Estudo ex vivo da ação do inibidor de Poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) em células mononucleares do sangue periférico de pacientes com sepse por SARS-CoV-2

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Data
2023-04-05
Autores
Rodrigues, Larissa de Oliveira Cavalcanti Peres [UNIFESP]
Orientadores
Salomão, Reinaldo [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Sepse, definida como uma disfunção orgânica potencialmente fatal causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. Desde o primeiro semestre de 2020, a sepse viral se destacou devido à pandemia de COVID-19. A sepse é caracterizada por apresentar respostas concomitantes de inflamação excessiva e imunossupressão nos indivíduos. Como consequência da resposta disfuncional do hospedeiro frente à infecção, ocorre uma série de alterações celulares e metabólicas, entre elas, a super ativação da enzima PARP-1. Quando há ativação exacerbada, PARP-1 leva ao consumo exagerado de NAD+ que prejudica a função mitocondrial e produção de ATP, comprometendo a viabilidade celular. Assim, a inibição de PARP-1 pode contribuir com o equilíbrio metabólico. Olaparibe, um inibidor de PARP, tem sido avaliado como um potencial uso terapêutico para o tratamento de sepse. Objetivo: Avaliar os efeitos de olaparibe em células mononucleares isoladas do sangue periférico de pacientes com sepse por SARS-CoV-2. Métodos: Foram incluídos dezoito pacientes com sepse por SARS-CoV-2 e seis voluntários sadios pareados em idade e gênero. A atividade da enzima PARP-1 foi avaliada utilizando a técnica de western blot para detectar proteínas pariladas. Os efeitos de olaparibe foram avaliados na viabilidade celular por meio da identificação de células apoptóticas; na função mitocondrial, através da detecção do potencial de membrana mitocondrial; e na produção de citocinas, medidas por citometria de fluxo utilizando o sistema de matriz de esferas citométricas. Resultados: A enzima PARP-1 foi encontrada na forma íntegra (116 kDa) em indivíduos sadios e na forma clivada (89 kDa) em pacientes. Foi detectada maior quantidade de parilação em indivíduos sadios em comparação aos pacientes. O tratamento com olaparibe na concentração de até 100 µM não afetou a viabilidade das células. Essa mesma concentração preservou o potencial de membrana mitocondrial das células dos pacientes e dos sadios ao proteger contra a despolarização após estímulo com H2O2 250µM. O uso de olaparibe, nas concentrações 10 µM e 100 µM, não modulou a produção de citocinas inflamatórias pelas células dos pacientes com sepse por SARS-CoV-2. Conclusão: Olaparibe não prejudica a viabilidade celular, apresenta efeito benéfico na função mitocondrial, entretanto não possui efeitos na modulação de citocinas inflamatórias.
Sepsis, defined as life-threatening organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection, is a major morbidity and mortality cause worldwide. From the first half of 2020, viral sepsis has been highlighted due to COVID-19 pandemic. Sepsis is characterized by presenting concurrent hyper inflammation and immunosuppression responses in individuals. As a consequence of a dysfunctional host response to infection, a series of cellular and metabolic alterations arise, including the overactivation of the PARP-1 enzyme. Once overactivated, PARP-1 leads to NAD+ overconsumption which decreases mitochondrial function and ATP production, impairing cell viability. Therefore, PARP-1 inhibition may contribute to metabolic balance. Olaparib, a PARP inhibitor, has been evaluated as a potential therapeutic use for sepsis treatment. Objective: To evaluate the effects of olaparib on mononuclear cells isolated from peripheral blood of patients with SARS-CoV-2 sepsis. Methods: Eighteen patients with sepsis caused by SARS-CoV-2 and six age and gender matched healthy volunteers were included. PARP-1 enzyme activity was determined using the western blot technique to detect parylated proteins. The effects of olaparib were evaluated on cell viability by identifying apoptotic cells; on mitochondrial function by detecting the mitochondrial membrane potential; and on cytokine production measured by flow cytometry using the cytometric bead array system. Results: PARP- 1 enzyme was detected as an intact form (116kDa) in healthy volunteers and as a cleaved form (89 kDa) in patients. A greater amount of parylation was observed in heathy volunteers compared to the patients. Treatment with olaparib at a concentration up to 100 µM did not affect cell viability while the same concentration preserved the cell mitochondrial membrane potential from both patients and healthy volunteers by protecting against depolarization after a stimulus with 250 µM H2O2. The use of olaparib at 10 µM and 100 µM concentrations, did not modulate inflammatory cytokines production by the cells from patients with sepsis caused by SARS-CoV-2. Conclusion: Olaparib does not impair cell viability, demonstrated a beneficial effect on cells mitochondrial function, however, olaparib was not effective in modulating the production of inflammatory cytokines.
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