Avaliação quantitativa e qualitativa de monócitos em pacientes com diabetes mellitus gestacional
Data
2017-10-26
Autores
Angelo, Ana Geisa Santos de 
Orientadores
Daher, Silvia
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: Immunological changes leading to a predominantly inflammatory profile seem to be involved in the pathophysiology of Gestational Diabetes Mellitus (GDM). The role of monocytes and their mediators in this process remains unclear. Objective: The aim of this study was to evaluate the profile of peripheral blood monocytes of patients with GDM and compare it with the observed in healthy pregnant and nonpregnant women. We quantified and evaluated the expression of TLR-4, chemokine CCR2 and cytokines (TNF-A, IL-6 and IL-10) in circulating monocytes of pregnant women with and without DMG and healthy nonpregnant women. Methods: This was a cross-sectional analytical study. Patients were enrolled in the 3 rd trimester of pregnancy, healthy and with GDM, and a group of healthy non-pregnant women. Peripheral blood was collected for quantitative evaluation of total monocytes and their subclasses, and also to characterize their spontaneous and post-stimulation by lipopolysaccharide (LPS) expression of TLR-4, CCR2 and cytokines. All participants underwent oral glucose tolerance test with 75g (TTOG) by the 20th week of gestation, and the diagnosis of GDM was established according to the IADPSG criteria. The percentages of total (CD14+ ), classic (CD14+CD16- ), intermediate (CD14+CD16+ ) and non-classical (CD14+CD16++) monocytes were assessed by flow cytometry. The same technique was used to evaluate the spontaneous and post-stimulation by LPS expression of TLR-4, CCR2, TNF-A + , IL-6 + and IL-10+ in all subclasses. Student t tests, One-Way ANOVA, Kruskal-Wallis, χ2, Pearson's correlation were used for statistical analysis. The level of significance was set at p<0.05. Results: Thirty-eight patients in the third trimester of pregnancy, 20 healthy and 18 patients with GDM, in addition to 18 non-pregnant women of reproductive age were included. The control xviii and DMG groups presented lower number of total CD14+ monocytes when compared to the non-pregnant group, both spontaneous (6,30 +/- 2,37 x 6,67 +/- 1,81 X 11,95 +/- 4,07, respectively, p <0,0001 - One-way ANOVA test) and after stimulation with LPS (Med: 5,37 x 5,24 x 9,74, Iq: 4,33 - 6,29 x 3,88 - 7,15 x 6,38 - 11,78 respectively, p=0,0005 - Kruskal-Wallis test). We did not observe statistically significant difference between the study groups when we analyzed the subsets of monocytes (classic, intermediate and nonclassical) in both situations: spontaneous production or stimulation with LPS. We observed lower expression of TLR-4 by classic monocytes of DMG patients, in comparison to the control and nonpregnant groups (Med: 39,40 x 71,65 x 63,30, Iq: 11,33 - 69,83 x 61,80 - 76,78 x 21,50 - 74,23 respectively, p=0,01 - Kruskal-Wallis test). The same occurred in the intermediate monocytes (Med: 84,25 x 100,00 x 100,00, Iq: 56,10 - 100,00 x 87,00 - 100,00 x 87,50 - 100,00 respectively, p = 0,04 - Kruskal-Wallis test) and, although it was not statistically significant in nonclassical monocytes, we also observed a tendency to lower expression of TLR-4 in the diabetic group (Med: 88,70 x 100,00 x 100,00, Iq: 55,55 - 100,00 x 88,03 - 100,00 x 86,10 - 100,00 respectively, p = 0,08 - KruskalWallis test). We also identified lower levels of sCD14 + in the control group when compared to DMG and non - pregnant groups (Med: 225,50 x 779,20 x 1383,00, Iq: 152,90 - 274,90 x 229,80 - 1623, 00 x 836,70 - 1658,00, respectively, p <0,0001 - Kruskal-Wallis test). As expected, we detected altered laboratory parameters in diabetic pregnant women (glycated hemoglobin: 5,72 +/- 0,33 x 5,32 +/- 0,41 x 5,33 +/- 0,31, respectively, p <0 , 0001 - One-way ANOVA test; fasting glycemia 89,60 +/- 5,55 x 81,52 +/- 8,64, p = 0,001 - Student's t-test). There was no correlation between percentages of CD14 + cells and levels of glycated hemoglobin and fasting glycemia. Conclusion: Patients with DMG had xix lower percentage of monocytes that spontaneously expressed TLR-4. Pregnant women with and without DMG had a lower percentage of total monocytes (CD14+ ) and of monocytes expressing IL-10+ than non-pregnant women.
Introdução: Alterações imunológicas com desenvolvimento de perfil predominantemente inflamatório parecem estar envolvidas na fisiopatologia do Diabetes Mellitus Gestacional (DMG). A participação de monócitos e de seus mediadores neste processo ainda não foi esclarecida. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de monócitos em sangue periférico de pacientes com DMG e, compará-lo com o de gestantes saudáveis e de não gestantes. Para tanto, quantificamos e avaliamos a expressão de TLR-4, da quimiocina CCR2 e de citocinas (TNF-A, IL-6 e IL-10) em monócitos circulantes de gestantes com e sem DMG e em mulheres não gestantes saudáveis. Métodos: Este foi um estudo do tipo transversal analítico. Foram selecionadas pacientes cursando o 3º trimestre da gestação, saudáveis e com DMG, e um grupo de mulheres não gestantes saudáveis. Foi coletado sangue periférico para avaliação quantitativa de monócitos totais e suas subclasses, e também para caracterizar a expressão fenotípica espontânea e pós-estimulação por lipopolissacarídeo (LPS) de TLR-4, CCR2 e de citocinas nestas células. Todas as participantes realizaram teste de tolerância oral a glicose com 75g (TTOG) até a 20ª semana de gestação, e o diagnóstico de DMG, foi estabelecido segundo os critérios do IADPSG. Foram avaliadas as porcentagens de monócitos total (CD14+ ), clássicos (CD14+CD16- ), intermediários (CD14+CD16+ ) e não clássicos (CD14+CD16++) por citometria de fluxo. A mesma técnica foi utilizada para avaliação da expressão espontânea e pós-estimulação por LPS de TLR-4, CCR2, TNF-A + , IL-6 + e IL-10+ em todas as subclasses. Para a análise estatística foram utilizados os testes t de Student, One-Way ANOVA, Kruskal-Wallis, χ 2, correlação de Pearson. O nível de significância foi estabelecido em p<0,05. Resultados: Foram incluídas 38 pacientes cursando o terceiro trimestre de gestação, sendo 20 saudáveis e xv 18 pacientes com DMG, além de 18 mulheres não gestantes em idade reprodutiva. Os grupos controle e com DMG apresentaram número menor de monócitos totais CD14+ quando comparadas com o grupo não gestantes, tanto na expressão espontânea (6,30 +/- 2,37 x 6,67 +/- 1,81 x 11,95 +/- 4,07, respectivamente, p<0,0001 - Teste One-way ANOVA), quanto após estímulo com LPS (Med: 5,37 x 5,24 x 9,74, Iq: 4,33 - 6,29 x 3,88 - 7,15 x 6,38 - 11,78 respectivamente, p=0,0005 – Teste Kruskal-Wallis). Não observamos diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo quando analisamos as demais subclasses de monócitos (clássicos, intermediários e não clássicos) em ambas as situações: produção espontânea ou estimulada por LPS. O grupo com DMG apresentou menor expressão de TLR-4 por monócitos clássicos quando comparado com os grupos controle e não gestantes (Med: 39,40 x 71,65 x 63,30, Iq: 11,33 - 69,83 x 61,80 - 76,78 x 21,50 - 74,23 respectivamente, p=0,01 – Teste de Kruskal-Wallis). O mesmo ocorreu nos monócitos intermediários (Med: 84,25 x 100,00 x 100,00, Iq: 56,10 - 100,00 x 87,00 - 100,00 x 87,50 - 100,00 respectivamente, p=0,04 – Teste de Kruskal-Wallis) e, embora não tenha sido estatisticamente significante em monócitos não clássicos, observamos uma tendência a menor expressão de TLR-4 também nas diabéticas (Med: 88,70 x 100,00 x 100,00, Iq: 55,55 - 100,00 x 88,03 - 100,00 x 86,10 - 100,00 respectivamente, p=0,08 – Teste de KruskalWallis). Identificamos também níveis mais baixos de sCD14+no grupo controle quando comparados aos grupos DMG e não gestante (Med: 225,50x 779,20 x 1383,00, Iq: 152,90 - 274,90 x 229,80 - 1623,00 x 836,70 - 1658,00, respectivamente, p<0,0001 – Teste de Kruskal-Wallis). Como esperado, identificamos alterações nos parâmetros laboratoriais nas gestantes diabéticas (hemoglobina glicada: 5,72 +/- 0,33 x 5,32 +/- 0,41 x 5,33 +/- 0,31, respectivamente, p<0,0001 - Teste One-way ANOVA; xvi glicemia de jejum 89,60 +/- 5,55 x 81,52 +/- 8,64, p=0,001 - Teste t de Student). Não foi demonstrada correlação entre as porcentagens de células CD14+ e os níveis de hemoglobina glicada e de glicemia de jejum. Conclusão: As pacientes com DMG apresentaram menor porcentagem de monócitos que espontaneamente expressavam TLR-4. Gestantes com e sem DMG apresentaram menor porcentagem de monócitos totais (CD14+ ) e, de monócitos que expressavam IL-10+ do que as não gestantes.
Introdução: Alterações imunológicas com desenvolvimento de perfil predominantemente inflamatório parecem estar envolvidas na fisiopatologia do Diabetes Mellitus Gestacional (DMG). A participação de monócitos e de seus mediadores neste processo ainda não foi esclarecida. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de monócitos em sangue periférico de pacientes com DMG e, compará-lo com o de gestantes saudáveis e de não gestantes. Para tanto, quantificamos e avaliamos a expressão de TLR-4, da quimiocina CCR2 e de citocinas (TNF-A, IL-6 e IL-10) em monócitos circulantes de gestantes com e sem DMG e em mulheres não gestantes saudáveis. Métodos: Este foi um estudo do tipo transversal analítico. Foram selecionadas pacientes cursando o 3º trimestre da gestação, saudáveis e com DMG, e um grupo de mulheres não gestantes saudáveis. Foi coletado sangue periférico para avaliação quantitativa de monócitos totais e suas subclasses, e também para caracterizar a expressão fenotípica espontânea e pós-estimulação por lipopolissacarídeo (LPS) de TLR-4, CCR2 e de citocinas nestas células. Todas as participantes realizaram teste de tolerância oral a glicose com 75g (TTOG) até a 20ª semana de gestação, e o diagnóstico de DMG, foi estabelecido segundo os critérios do IADPSG. Foram avaliadas as porcentagens de monócitos total (CD14+ ), clássicos (CD14+CD16- ), intermediários (CD14+CD16+ ) e não clássicos (CD14+CD16++) por citometria de fluxo. A mesma técnica foi utilizada para avaliação da expressão espontânea e pós-estimulação por LPS de TLR-4, CCR2, TNF-A + , IL-6 + e IL-10+ em todas as subclasses. Para a análise estatística foram utilizados os testes t de Student, One-Way ANOVA, Kruskal-Wallis, χ 2, correlação de Pearson. O nível de significância foi estabelecido em p<0,05. Resultados: Foram incluídas 38 pacientes cursando o terceiro trimestre de gestação, sendo 20 saudáveis e xv 18 pacientes com DMG, além de 18 mulheres não gestantes em idade reprodutiva. Os grupos controle e com DMG apresentaram número menor de monócitos totais CD14+ quando comparadas com o grupo não gestantes, tanto na expressão espontânea (6,30 +/- 2,37 x 6,67 +/- 1,81 x 11,95 +/- 4,07, respectivamente, p<0,0001 - Teste One-way ANOVA), quanto após estímulo com LPS (Med: 5,37 x 5,24 x 9,74, Iq: 4,33 - 6,29 x 3,88 - 7,15 x 6,38 - 11,78 respectivamente, p=0,0005 – Teste Kruskal-Wallis). Não observamos diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo quando analisamos as demais subclasses de monócitos (clássicos, intermediários e não clássicos) em ambas as situações: produção espontânea ou estimulada por LPS. O grupo com DMG apresentou menor expressão de TLR-4 por monócitos clássicos quando comparado com os grupos controle e não gestantes (Med: 39,40 x 71,65 x 63,30, Iq: 11,33 - 69,83 x 61,80 - 76,78 x 21,50 - 74,23 respectivamente, p=0,01 – Teste de Kruskal-Wallis). O mesmo ocorreu nos monócitos intermediários (Med: 84,25 x 100,00 x 100,00, Iq: 56,10 - 100,00 x 87,00 - 100,00 x 87,50 - 100,00 respectivamente, p=0,04 – Teste de Kruskal-Wallis) e, embora não tenha sido estatisticamente significante em monócitos não clássicos, observamos uma tendência a menor expressão de TLR-4 também nas diabéticas (Med: 88,70 x 100,00 x 100,00, Iq: 55,55 - 100,00 x 88,03 - 100,00 x 86,10 - 100,00 respectivamente, p=0,08 – Teste de KruskalWallis). Identificamos também níveis mais baixos de sCD14+no grupo controle quando comparados aos grupos DMG e não gestante (Med: 225,50x 779,20 x 1383,00, Iq: 152,90 - 274,90 x 229,80 - 1623,00 x 836,70 - 1658,00, respectivamente, p<0,0001 – Teste de Kruskal-Wallis). Como esperado, identificamos alterações nos parâmetros laboratoriais nas gestantes diabéticas (hemoglobina glicada: 5,72 +/- 0,33 x 5,32 +/- 0,41 x 5,33 +/- 0,31, respectivamente, p<0,0001 - Teste One-way ANOVA; xvi glicemia de jejum 89,60 +/- 5,55 x 81,52 +/- 8,64, p=0,001 - Teste t de Student). Não foi demonstrada correlação entre as porcentagens de células CD14+ e os níveis de hemoglobina glicada e de glicemia de jejum. Conclusão: As pacientes com DMG apresentaram menor porcentagem de monócitos que espontaneamente expressavam TLR-4. Gestantes com e sem DMG apresentaram menor porcentagem de monócitos totais (CD14+ ) e, de monócitos que expressavam IL-10+ do que as não gestantes.