Síntese, estudos conformacionais e atividade biológica de novos análogos do peptídeo antimicrobiano gomesina
Data
2016-08-31
Autores
Mendes, Roberta Brandao 
Orientadores
Miranda, Antonio de
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Gomesin (ZCRRLCYKQRCVTYCRGR-NH2) is an antimicrobial peptide isolated from hemocytes of the Brazilian spider Acanfhoscurria gomesiana. The molecule has four cysteines that form two intramolecular disulfide bridges at positions 2.15 and 6.11. Gm has a broad spectrum of action and a high toxicity against human erythrocytes. This study aimed to the synthesis of new analogues of gomesin to evaluate their structure-activity and their mechanisms of action in comparison to Gm. Thus, linear and cyclic analogs were synthesized, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15, Ac-Ifrp", D-Lys8]-Gm2-15, Ac- [Thr2,6,11,15]-Gm2_1A5c, -[ Thr2,6,11,15,D-Lys8]-Gm2_1a5nd Ac-[Thr2,6,11,15,D-Pro9]-Gm2_1b5y using the solid phase peptides synthesis in a t-Boc strategy. Then peptides were cleaved, purified and characterized. Antimicrobial activity were evaluated against C. albicans, B. megaferium, P. aeruginosa, P. expansum, C. neoformans, A. niger, Cladosporium sp and S. cerevisiae; hemolytic activity was determined against human erythrocytes; Peptides degradation resistance in human plasma and antitumoral activity against K562 cells were also evaluated. Structural analysis by Circular Dichroism spectroscopy and peptide/vesicle interaction using giant unilamellar vesicles and optical microscopy were also performed. Thermodynamical studies of the interaction peptide I lipid using large unilamellar vesicles (LUVs) was done by isothermal titration calorimetry (ITC). Our results showed that analogues, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15 and Ac-IIrp", D-Lys8]-Gm2-15, presented the best antimicrobial activity, particularly against microorganisms A. nigerand S. cerevisiae, their performance were even better than Gm. Ali showed low hemolytic activity even at 100 IJM concentration. They were quite resistant to degradation. Fro the Circular Dichroism studies, we observed that the cyclic compounds showed conformations similar than to gomesin, they also assume a p-hairpin conformation. On the other hand, linear analogues showed a prevalence of random conformation. The Iytic mechanism of action of Gm and Ac-Gm2-15 showed to be very similar, both of them caused a disruption of the membrane. Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_1p5resented a pore formation mechanism. From our results, we had confirmed the crucial importance of the disulfide bridges in the Iytic mechanism of action; in fact its removal causes a decrease in the antimicrobial, hemolytic and antitumor activities. The disulfide bridges also have a great contribution to the stability and strength the action against plasma protease. Gomesin fragments should have less potency, maybe due to the lower amount of charge and also because of the removal of amino acids in the N- and C-terminal portions
A gomesina (ZCRRLCYKQRCVTYCRGR-NH2) é um peptídeo antimicrobiano isolado a partir dos hemócitos da aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana possuindo quatro cisteínas que formam duas pontes de dissulfeto intramoleculares nas posições 2,15 e 6,11. É um PAM que possui um largo espectro de ação e uma alta toxicidade contra eritrócitos humanos. Este estudo teve como objetivo a síntese de novos análogos da gomesina para avaliar sua estrutura-atividade e seus mecanismos de ação em comparação com a Gm. Desta forma, foram sintetizados os análogos cíclicos e lineares, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15, Ac-[Trp7, D-Lys8]-Gm2-15, Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_15A,c-[ Thr2,6,11,15,D-Lys8]-Gm2_15e Ac-[Thr2,6,11,15,D-Pro9]-Gm2_15,utilizando a síntese de peptídeos em fase sólida pela estratégia t-Boc. Em seguida os peptídeos foram clivados, purificados e caracterizados. Foram realizados ensaios de atividade antimicrobiana contra Candida albicans, 8acillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Penicillium expansum, Criptococcus neoformans, Aspergillus niger, Cladosporium sp e Saccharomyces cerevisiae; atividade hernolltica sendo determinada contra eritrócitos humanos; atividade antitumoral contra células eritroleucêmicas da linhagem K562, estabilidade dos peptídeos utilizando plasma humano, estudos de análise estrutural por espectroscopia de Dicroísmo Circular, interação peptídeo/vesícula utilizando-se vesículas unilamelares gigantes (GUVs) compostas por misturas de um lipídio neutro (POPC) com um lipídio carregado negativamente (POPG) através de microscopia ótica e estudos termodinâmicos da interação peptídeo/lipídeo utilizando vesículas unilamelares grandes (LUVs) que foram injetadas em soluções peptídicas por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Para o ensaio de interação peptídeo/vesícula e estudos termodinâmicos da interação peptídeo/lipídeo, foram testados somente o análogo cíclico Ac-Gm2-15e o linear Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_p1a5ra avaliação da importância das pontes de dissulfeto e dos resíduos de aminoácidos retirados nas porções C- e Nterminal. Os resultados mostraram que os análogos Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15e Ac- [Trp", D-Lys8]-Gm2-15, foram os que apresentaram as melhores atividades antimicrobianas, principalmente contra os microrganismos A. nigere S. cere visiae, sendo melhores que a Gm. Todos apresentaram uma baixa atividade hernolltica, mesmo na concentração de 100 IJM e foram bastante resistentes a degradação. Nos estudos por Dicroísmo Circular, pudemos observar que os compostos cíclicos apresentaram conformações similares ao da gomesina, sendo em forma de I3-Hairpin e os análogos lineares apresentaram uma prevalência de conformação randômica. O mecanismo de ação lltica da Gm e do análogo Ac-Gm2-15 foram muito parecidos, sendo por desestruturação da membrana e o Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_a1p5resentou um mecanismo de formação de poro. A partir dos resultados obtidos, foi possível confirmar que as pontes de dissulfeto são importantes para o mecanismo de ação lítica, uma vez que a sua remoção causa uma diminuição das atividades antimicrobianas, hernollticas e antitumorais, além de possuir uma grande contribuição na estabilidade e resistência a ação das proteases plasmáticas e que os fragmentos estudados podem ter sido menos potentes devido a menor quantidade de cargas e também devido a retirada dos aminoácidos nas porções N- e C-terminal.
A gomesina (ZCRRLCYKQRCVTYCRGR-NH2) é um peptídeo antimicrobiano isolado a partir dos hemócitos da aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana possuindo quatro cisteínas que formam duas pontes de dissulfeto intramoleculares nas posições 2,15 e 6,11. É um PAM que possui um largo espectro de ação e uma alta toxicidade contra eritrócitos humanos. Este estudo teve como objetivo a síntese de novos análogos da gomesina para avaliar sua estrutura-atividade e seus mecanismos de ação em comparação com a Gm. Desta forma, foram sintetizados os análogos cíclicos e lineares, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15, Ac-[Trp7, D-Lys8]-Gm2-15, Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_15A,c-[ Thr2,6,11,15,D-Lys8]-Gm2_15e Ac-[Thr2,6,11,15,D-Pro9]-Gm2_15,utilizando a síntese de peptídeos em fase sólida pela estratégia t-Boc. Em seguida os peptídeos foram clivados, purificados e caracterizados. Foram realizados ensaios de atividade antimicrobiana contra Candida albicans, 8acillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Penicillium expansum, Criptococcus neoformans, Aspergillus niger, Cladosporium sp e Saccharomyces cerevisiae; atividade hernolltica sendo determinada contra eritrócitos humanos; atividade antitumoral contra células eritroleucêmicas da linhagem K562, estabilidade dos peptídeos utilizando plasma humano, estudos de análise estrutural por espectroscopia de Dicroísmo Circular, interação peptídeo/vesícula utilizando-se vesículas unilamelares gigantes (GUVs) compostas por misturas de um lipídio neutro (POPC) com um lipídio carregado negativamente (POPG) através de microscopia ótica e estudos termodinâmicos da interação peptídeo/lipídeo utilizando vesículas unilamelares grandes (LUVs) que foram injetadas em soluções peptídicas por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Para o ensaio de interação peptídeo/vesícula e estudos termodinâmicos da interação peptídeo/lipídeo, foram testados somente o análogo cíclico Ac-Gm2-15e o linear Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_p1a5ra avaliação da importância das pontes de dissulfeto e dos resíduos de aminoácidos retirados nas porções C- e Nterminal. Os resultados mostraram que os análogos Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15e Ac- [Trp", D-Lys8]-Gm2-15, foram os que apresentaram as melhores atividades antimicrobianas, principalmente contra os microrganismos A. nigere S. cere visiae, sendo melhores que a Gm. Todos apresentaram uma baixa atividade hernolltica, mesmo na concentração de 100 IJM e foram bastante resistentes a degradação. Nos estudos por Dicroísmo Circular, pudemos observar que os compostos cíclicos apresentaram conformações similares ao da gomesina, sendo em forma de I3-Hairpin e os análogos lineares apresentaram uma prevalência de conformação randômica. O mecanismo de ação lltica da Gm e do análogo Ac-Gm2-15 foram muito parecidos, sendo por desestruturação da membrana e o Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_a1p5resentou um mecanismo de formação de poro. A partir dos resultados obtidos, foi possível confirmar que as pontes de dissulfeto são importantes para o mecanismo de ação lítica, uma vez que a sua remoção causa uma diminuição das atividades antimicrobianas, hernollticas e antitumorais, além de possuir uma grande contribuição na estabilidade e resistência a ação das proteases plasmáticas e que os fragmentos estudados podem ter sido menos potentes devido a menor quantidade de cargas e também devido a retirada dos aminoácidos nas porções N- e C-terminal.
Descrição
Citação
MENDES, Roberta Brandao. Síntese, estudos conformacionais e atividade biológica de novos análogos do peptídeo antimicrobiano gomesina. 2016. 95 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas: Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.