Papel de oct4, sox2 e caspase-3 na quiescência dos gonócitos de rato
Data
2014-10-29
Autores
Arantes, Anelise Diniz 
Orientadores
Teixeira, Taiza Stumpp Teixeira
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: The germ cells emerge from the epiblast and migrate to the gonads, where they become gonocytes. The gonocytes are the precursors of the spermatogonial stem cells, but little is known about their differentiation. It is seems that the rigid control of gonocyte proliferation, quiescence and pluripotent marker expression is crucial for germ cell development. Objective: Identify the pre-natal period of male germ cell quiescence in the rat and whether caspase-3 (Casp3) is involved in the process. Methods: Rat embryonic gonads were collected at 15, 17 and 19 days post-coitum (dpc). The expression of pluripotency (SOX2, OCT4) and proliferation (Ki67, phosphorylated Retinoblastoma 1 (pRb1)) markers as well as of cleaved Casp3 was analysed. To address Casp3 role in rat gonocyte quiescence, testes from 19dpc embryos were incubated with Casp3 inhibitor and submitted to the immunolabelling of Ki67, PCNA, Casp3 and NANOG. Results: The number of Ki67 and pRB1-labelled gonocytes reduced from 15dpc to 17dpc reaching zero at 19dpc, indicating that quiescence starts around 15dpc and that they are quiescent at 19dpc. OCT4 labelling followed the same detection pattern, whereas SOX2 was present only at 15dpc. These data suggest that the establishment of the quiescence period involves the downregulation of these pluripotent markers. Casp3 labelling was opposite to OCT4, pRB1 and Ki67 labelling, suggesting that it has a role in rat gonocyte quiescence. Casp3 labelling was maintained after the incubation with Casp3 inhibitor, what was expected since the inhibitor does not induce Casp3 degradation. Ki67 was not detected in the gonads incubated with Casp3 inhibitor, suggesting that Caps3 inhibition does not reactivate the cell cycle. NANOG was detected in the gonocyte cytoplasm at 19dpc and its labelling was identical to that of Casp3, suggesting that it has a role in the control of germ cell cycle in the embryo and may interact with Casp3. PCNA-positive and negative gonocytes were observed in 19dpc gonads before and after culture. However, the number of PCNA-negative gonocytes increased in the gonads incubated with Casp3-inhibitor, suggesting that Casp3 is a positive regulator of PCNA. Conclusion: These results suggest that OCT4 and SOX2 downregulation as well as Casp3 and NANOG expression are involved in rat gonocyte quiescence and that PCNA depend on Casp3 activity in these cells.
Introdução: As células germinativas originam-se do epiblasto e migram para as gônadas, onde se tornam gonócitos. Os gonócitos são os precursores das espermatogônias tronco, mas pouco se sabe sobre a sua diferenciação. O controle rígido de proliferação, quiescência e expressão de marcadores pluripotentes dos gonócitos é crucial para o desenvolvimento das células germinativas. Objetivo: Identificar a fase embrionária do período de quiescência dos gonócitos de rato e se a Caspase-3 (Casp3) atua nesse processo. Métodos: Gônadas embrionárias de ratos foram coletadas aos 15, 17 e 19 dias pós coito (dpc). A expressão de Casp3 clivada, de marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4) e proliferação (Ki67, Retinoblastoma fosforilada 1 (pRB1)) foi analisada. Testículos de embrião de 19dpc foram incubados com inibidor de Casp3 e submetidos à marcação de Ki67, PCNA, Casp3 e NANOG para investigação do papel desta enzima na quiescência dos gonócitos de rato. Resultados: Gonócitos positivos para Ki67 e pRB1 foram observados aos 15dpc e, em menor número aos 17dpc. Aos 19dpc todos os gonócitos estavam negativos para estas proteínas, indicando que o período de quiescência tem início aos 15dpc e que aos 19dpc todos os gonócitos estão em quiescência. A marcação de OCT4 seguiu o mesmo padrão, enquanto o SOX2 foi detectado somente aos 15dpc. Estes resultados sugerem que o estabelecimento do período de quiescência dos gonócitos de rato envolve a inibição da expressão desses marcadores de pluripotência. A marcação da Casp3 seguiu exatamente o padrão inverso da expressão de Ki67, pRB1 e OCT4, indicando que a quiescência dos gonócitos de rato envolve o aumento da expressão desta proteína. A Casp3 manteve-se presente nas gônadas incubadas com inibidor de Casp3, o que já era esperado, pois o inibidor não implica na degradação da proteína. O Ki67 se manteve ausente nos gonócitos, indicando que a inibição de Casp3 não reativa o ciclo celular. O NANOG foi detectado no citoplasma dos gonócitos aos 19dpc e seu padrão de detecção foi idêntico ao da Casp3, sugerindo que este marcador de pluripotência atua no controle do ciclo celular das células germinativas durante a fase embrionária e talvez interaja com a Casp3. Gonócitos positivos e negativos para PCNA foram observados aos 19dpc. O padrão de detecção do PCNA nas gônadas submetidas à cultura foi o mesmo. Entretanto, as gônadas tratadas com inibidor de Casp3 apresentaram maior quantidade de gonócitos negativos, sugerindo que a Casp3 é um regulador positivo do PCNA. Conclusões: Estes resultados sugerem que a inibição de OCT4 e SOX2, bem como a expressão de Casp3 e NANOG estão envolvidos na quiescência dos gonócitos de rato e que o PCNA depende da atividade da Casp3 nessas células.
Introdução: As células germinativas originam-se do epiblasto e migram para as gônadas, onde se tornam gonócitos. Os gonócitos são os precursores das espermatogônias tronco, mas pouco se sabe sobre a sua diferenciação. O controle rígido de proliferação, quiescência e expressão de marcadores pluripotentes dos gonócitos é crucial para o desenvolvimento das células germinativas. Objetivo: Identificar a fase embrionária do período de quiescência dos gonócitos de rato e se a Caspase-3 (Casp3) atua nesse processo. Métodos: Gônadas embrionárias de ratos foram coletadas aos 15, 17 e 19 dias pós coito (dpc). A expressão de Casp3 clivada, de marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4) e proliferação (Ki67, Retinoblastoma fosforilada 1 (pRB1)) foi analisada. Testículos de embrião de 19dpc foram incubados com inibidor de Casp3 e submetidos à marcação de Ki67, PCNA, Casp3 e NANOG para investigação do papel desta enzima na quiescência dos gonócitos de rato. Resultados: Gonócitos positivos para Ki67 e pRB1 foram observados aos 15dpc e, em menor número aos 17dpc. Aos 19dpc todos os gonócitos estavam negativos para estas proteínas, indicando que o período de quiescência tem início aos 15dpc e que aos 19dpc todos os gonócitos estão em quiescência. A marcação de OCT4 seguiu o mesmo padrão, enquanto o SOX2 foi detectado somente aos 15dpc. Estes resultados sugerem que o estabelecimento do período de quiescência dos gonócitos de rato envolve a inibição da expressão desses marcadores de pluripotência. A marcação da Casp3 seguiu exatamente o padrão inverso da expressão de Ki67, pRB1 e OCT4, indicando que a quiescência dos gonócitos de rato envolve o aumento da expressão desta proteína. A Casp3 manteve-se presente nas gônadas incubadas com inibidor de Casp3, o que já era esperado, pois o inibidor não implica na degradação da proteína. O Ki67 se manteve ausente nos gonócitos, indicando que a inibição de Casp3 não reativa o ciclo celular. O NANOG foi detectado no citoplasma dos gonócitos aos 19dpc e seu padrão de detecção foi idêntico ao da Casp3, sugerindo que este marcador de pluripotência atua no controle do ciclo celular das células germinativas durante a fase embrionária e talvez interaja com a Casp3. Gonócitos positivos e negativos para PCNA foram observados aos 19dpc. O padrão de detecção do PCNA nas gônadas submetidas à cultura foi o mesmo. Entretanto, as gônadas tratadas com inibidor de Casp3 apresentaram maior quantidade de gonócitos negativos, sugerindo que a Casp3 é um regulador positivo do PCNA. Conclusões: Estes resultados sugerem que a inibição de OCT4 e SOX2, bem como a expressão de Casp3 e NANOG estão envolvidos na quiescência dos gonócitos de rato e que o PCNA depende da atividade da Casp3 nessas células.
Descrição
Citação
ARANTES, Anelise Diniz. Papel de oct4, sox2 e caspase-3 na quiescência dos gonócitos de rato. 2014. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.