Proteínas dissulfeto isomerase (PDIs): relação com hormônios esteroidais sexuais e função epididimária
Data
2019-07-25
Autores
Fernandes, Samuel Guilerme 
Orientadores
Winston, Maria Christina Werneck De Avellar
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Protein disulfide isomerase (PDI) family is a member of the thioredoxin protein superfamily. There are at least 21 genes encoding PDIs that greatly vary in their protein structure, tissue expression, and cellular distribution. PDIs are multifunctional chaperones primarily involved in the catalysis of thiol-disulfide exchange reactions for protein folding, which are rate-limiting steps for protein maturation in the endoplasmic reticulum. In addition to their roles in different physiological processes, including sperm maturation and male fertility, PDIs have also been associated with several pathologies. The mechanisms by which PDIs regulate the male reproductive function in health and disease, however, are still poorly understood. Surprisingly, we observed in pilot studies that transcripts encoded by at least 20 Pdi genes are present in the caput epididymis from adult rats. Considering the crucial role of the epididymis to sperm function, we set to uncover in the present study the expression pattern and androgen regulation of a subset of Pdi genes (P4hb, Pdia3, Pdia5, Pdia6, Pdilt and Erp29) in the epididymis of developing rats. Firstly, we detected Pdi mRNAs in the Wolffian duct (embryonic epididymal precursor) from fetuses at embryonic ages (e) e17.5 and e20.5, a temporal window when epididymal morphogenesis occurs; in contrast to similar mRNA levels of Pdilt and Erp29 genes, upregulation of P4hb, Pdia3, Pdia5 and Pdia6 mRNA was observed in WD from e17.5 to e20.5. Next, we observed that these Pdi genes were differentially expressed during postnatal in epididymis from neonatal rats (pnd1, pnd5, pnd10 and pnd20; whole epididymis) and in epididymal regions from sexually immature (pnd40) and mature rats (adult, pnd120); in these studies, only Pdia3, Pdia5 and Pdia6 genes displayed significant age-related changes in their transcript levels. Surgical castration, followed or not by testosterone replacement and efferent ductules ligation were then performed in adult rats to evaluate Pdi gene modulation by androgens and/or testicular factors, respectively. The downregulation of Pdia3, Pdia5, Pdia6 and Erp29 transcripts in androgen-deprived caput epididymis was prevented by testosterone replacement, indicating their positive regulation by androgens. Conversely, the castration-induced decrease in caput epididymis P4hb and Pdilt mRNA levels were only partially or not restored, respectively, by the androgen treatment. P4hb was the only Pdi gene to be downregulated following efferent ductules ligation, suggesting its modulation by both androgens and testicular factors. The bioinformatic-based analysis revealed potential role for androgen/AR signaling pathways in the regulatory modulation of some, but not all Pdi genes. Lastly, immunohistochemistry was conducted with antibodies against two PDIs, i.e. PDILT and P4HB; both PDIs were immunolocalized in epithelial and non-epithelial cells along the adult epididymis and also in the luminal spermatozoa. Altogether, our results give support for PDIs as novel players in the developing and adult epididymis.
Família das Proteínas Dissulfeto Isomerase (PDI) é membro da superfamília de tiorredoxinas. Há pelo menos 21 genes que codificam PDIs que variam em sua estrutura proteica, expressão tecidual e distribuição celular. As PDIs são chaperonas multifuncionais envolvidas primariamente com a catálise de reações de troca tiol-dissulfeto, etapa limitante na maturação proteica no retículo endoplasmático. Além de atuarem em diferentes processos fisiológicos, incluindo a maturação espermática e fertilidade masculina, as PDIs também têm sido associadas a várias patologias. Entretanto, os mecanismos pelos quais as PDIs regulam a função reprodutiva masculina ainda são pouco compreendidos. Em experimentos pilotos, nós observamos de que pelo menos 20 genes de Pdis são expressos na cabeça do epidídimo de ratos adultos. Considerando o papel crucial do epidídimo na função espermática, propusemos neste estudo avaliar a expressão e a modulação por androgênios de um subgrupo de genes Pdi (P4hb, Pdia3, Pdia5, Pdia6, Pdilt and Erp29) no epidídimo de ratos em desenvolvimento. Primeiramente, detectamos mRNAs de Pdis no ducto de Wolff (WD) de fetos nas idades embrionárias (e) e17,5 e e20,5, período no qual ocorre a morfogênese epididimária; em contraste aos genes Pdilt e Erp29 que apresentam expressão similar, houve uma modulação positiva da expressão do P4hb, Pdia3, Pdia5 e Pdia6 entre as idades e17,5 e e20,5. A seguir, identificamos expressão diferencial destes transcritos durante o período pós-natal no epidídimo de ratos neonatais (pnd1, pnd5, pnd10 e pnd20; epidídimo inteiro) e em ratos sexualmente imaturos (pnd40) e maduros (adultos, pnd120); somente os genes Pdia3, Pdia5 e Pdia6 mostraram mudanças de expressão ao longo das idades. A castração cirúrgica, seguida ou não de reposição de testosterona, e ligadura de dúctulos eferentes (EDL) em ratos adultos foram usados para avaliar, respectivamente, a modulação desses transcritos por androgênios e/ou fatores testiculares. A modulação negativa dos transcritos Pdia3, Pdia5, Pdia6, Erp29, Pdilt e P4hb na cabeça do epidídimo de ratos privados de androgênios foi prevenida pela reposição de testosterona, indicando serem estes modulados positivamente por androgêncios. A diminuição da concentração de transcritos da P4hb e Pdilt com a castração foi parcialmente ou não alterada, respectivamente, pela reposição hormonal. P4hb foi o único gene a ser regulado negativamente após a ligadura dos dúctulos eferentes, sugerindo ser este alvo de modulação por androgênios e fatores testiculares. Análises baseadas em bioinformática revelaram um papel potencial para a sinalização androgênica/receptor de androgênio para alguns genes Pdis. Adicionalmente, a imunohistoquímica com anticorpos contra as PDILT e P4HB mostraram imunodistribuição dessas PDIs em células epiteliais e não-epiteliais do epidídimo de ratos adultos e em espermatozóides luminais. Em conjunto, os resultados apontam para as PDIs como novos componentes da fisiologia do epidídimo em desenvolvimento e adulto.
Família das Proteínas Dissulfeto Isomerase (PDI) é membro da superfamília de tiorredoxinas. Há pelo menos 21 genes que codificam PDIs que variam em sua estrutura proteica, expressão tecidual e distribuição celular. As PDIs são chaperonas multifuncionais envolvidas primariamente com a catálise de reações de troca tiol-dissulfeto, etapa limitante na maturação proteica no retículo endoplasmático. Além de atuarem em diferentes processos fisiológicos, incluindo a maturação espermática e fertilidade masculina, as PDIs também têm sido associadas a várias patologias. Entretanto, os mecanismos pelos quais as PDIs regulam a função reprodutiva masculina ainda são pouco compreendidos. Em experimentos pilotos, nós observamos de que pelo menos 20 genes de Pdis são expressos na cabeça do epidídimo de ratos adultos. Considerando o papel crucial do epidídimo na função espermática, propusemos neste estudo avaliar a expressão e a modulação por androgênios de um subgrupo de genes Pdi (P4hb, Pdia3, Pdia5, Pdia6, Pdilt and Erp29) no epidídimo de ratos em desenvolvimento. Primeiramente, detectamos mRNAs de Pdis no ducto de Wolff (WD) de fetos nas idades embrionárias (e) e17,5 e e20,5, período no qual ocorre a morfogênese epididimária; em contraste aos genes Pdilt e Erp29 que apresentam expressão similar, houve uma modulação positiva da expressão do P4hb, Pdia3, Pdia5 e Pdia6 entre as idades e17,5 e e20,5. A seguir, identificamos expressão diferencial destes transcritos durante o período pós-natal no epidídimo de ratos neonatais (pnd1, pnd5, pnd10 e pnd20; epidídimo inteiro) e em ratos sexualmente imaturos (pnd40) e maduros (adultos, pnd120); somente os genes Pdia3, Pdia5 e Pdia6 mostraram mudanças de expressão ao longo das idades. A castração cirúrgica, seguida ou não de reposição de testosterona, e ligadura de dúctulos eferentes (EDL) em ratos adultos foram usados para avaliar, respectivamente, a modulação desses transcritos por androgênios e/ou fatores testiculares. A modulação negativa dos transcritos Pdia3, Pdia5, Pdia6, Erp29, Pdilt e P4hb na cabeça do epidídimo de ratos privados de androgênios foi prevenida pela reposição de testosterona, indicando serem estes modulados positivamente por androgêncios. A diminuição da concentração de transcritos da P4hb e Pdilt com a castração foi parcialmente ou não alterada, respectivamente, pela reposição hormonal. P4hb foi o único gene a ser regulado negativamente após a ligadura dos dúctulos eferentes, sugerindo ser este alvo de modulação por androgênios e fatores testiculares. Análises baseadas em bioinformática revelaram um papel potencial para a sinalização androgênica/receptor de androgênio para alguns genes Pdis. Adicionalmente, a imunohistoquímica com anticorpos contra as PDILT e P4HB mostraram imunodistribuição dessas PDIs em células epiteliais e não-epiteliais do epidídimo de ratos adultos e em espermatozóides luminais. Em conjunto, os resultados apontam para as PDIs como novos componentes da fisiologia do epidídimo em desenvolvimento e adulto.