A investigação do inflamassoma NLRP3 no desenvolvimento da glomeruloesclerose segmentar e focal experimental
Data
2020-01-30
Autores
Santos, Amandda Rakel Peixoto Dos 
Orientadores
Silva Filho, Alvaro Pacheco E
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Introduction. Chronic inflammation has been associated with several diseases including chronic kidney disease (CKD), and among those, focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), a glomerulopathy in which inflammatory and degenerative mechanisms are implicated in podocyte damage. FSGS is a disease in which 50% of the patients are resistant to corticotherapy. In the past decades, the innate immune sensor system called NLRP3 inflammasome has been widely studied, showing its important contribution to the immune response. However, little has been investigated about FSGS and NLRP3 inflammasome. Aims. As it has been observed in other diseases, we speculated that NLRP3 inflammasome may also contribute to the development of FSGS. Therefore, we have investigated NLRP3 inflammasome components in experimental FSGS in order to unravel new mechanisms of the immune responses in renal diseases. Methods. Through Adriamycin Nephropathy (DOX) in wild type mice, C57BL/6J, mutants, such as NLRP3 KO, ASC KO, CASP-1 KO, and CRE Lox transgenic mice, we evaluated and compared NLRP3 inflammasome activation. We studied renal function, as well as gene and protein expression of molecules associated with podocytopathy, inflammation and tissue repair. Results. Our data showed that NLRP3 inflammasome activation happened early, in the second day of the nephropathy model, in C57BL/6J, with increased expression of nlrp3 (p=0,0275), casp-1 (p=0,0038), pro-il-18 (p<0,0001) and serum IL-18 (p<0,0001), associated with diminished expression of genes responsible for structural podocytes proteins and slit diaphragm proteins, actn4, synpo, nphs1 and kirrel (p<0,0001), we have also found diminished numbers of podocytes, WT1 (p=0,0009), and podocyte effacement through transmission electron microscopy (TEM). Among the knockout and CRE Lox transgenic mice, we pointed out that NLRP3 KO were protected against DOX- induced injury, podocytes mainly, not showing differences in podocytes molecules expression between the groups (p>0,05), or significant changes in podocytes structure by TEM; and, although they have presented increased expression of col4a1 (p=0,0056), fsp-1 (p=0,0217) and il-33 (p=0,0132), the mmp9/timp1 ratio was decreased (p<0,0001), indicating less extracellular matrix deposit when nlrp3 is not present. Conclusions. Our results indicated that NLRP3 inflammasome participates in experimental FSGS development, specially through IL-18 and IL-33 modulation. We believe that NLRP3 inflammasome activation promotes severe podocyte damage through IL-18, but, on the other hand, without NLRP3 inflammasome, IL-33 is not inactivated by caspase-1, and without this important limiting mechanism, IL-33 induces cellular infiltration and augmented expression of pro-fibrotic molecules. Thus, NLRP3 inflammasome and FSGS relation should be deeply investigated to guide the development of drugs that act accurately, blocking podocyte damage, without compromising the surveillance of this important innate immunity component.
Introdução. A inflamação crônica está associada a diversas doenças, incluindo a doença renal crônica (DRC), como a glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), uma glomerulopatia em que mecanismos inflamatórios e degenerativos estão associados ao dano podocitário. A GESF é uma doença de difícil tratamento, na qual 50% dos pacientes são resistentes à corticoterapia. Nas últimas duas décadas, o sistema sensor denominado inflamassoma NLRP3 tem sido extensamente estudado, demonstrando sua importante contribuição à resposta imune inata. No entanto, pouco foi explorado sobre a relação GESF e o inflamassoma NLRP3. Objetivos. Assim como ocorre em outras doenças, acreditamos que o inflamassoma NLRP3 também possa contribuir para o desenvolvimento da GESF. Neste sentido, investigamos a participação dos componentes dessa via na GESF experimental a fim de desvendar novos mecanismos da resposta imune na doença renal. Métodos. Através do modelo de nefropatia induzida por Adriamicina (DOX) em animais selvagem, C57BL/6J, mutantes, NLRP3 KO, ASC KO, CASP-1 KO, e transgênicos do Sistema Cre-Lox, avaliamos e comparamos a ativação do inflamassoma NLRP3. Estudamos a função renal e a expressão gênica e proteica de moléculas relacionadas à podocitopatia, a inflamação e reparo tecidual. Resultados. Verificamos que a ativação do inflamassoma NLRP3 acontece precocemente, no segundo dia do modelo, em animais C57BL/6J, com aumento da expressão de nlrp3 (p=0,0275), casp-1 (p=0,0038), pró-il-18 (p<0,0001) e IL-18 sérica (p<0,0001), associado à diminuição expressiva dos genes que codificam as proteínas da estrutura dos podócitos e da fenda do diafragma podocitário, actn4, synpo, nphs1 e kirrel (p<0,0001), além da diminuição do número de podócitos, WT1 (p=0,0009), e, por eletromicrografia de transmissão, apagamento dos pedicelos. Dentre os animais knockouts e transgênicos, destacamos que os animais NLRP3 KO estavam protegidos contra o dano provocado pela DOX, a nível de podócitos, não apresentando diferenças entre os grupos quanto à expressão de moléculas podocitárias (p>0,05) ou alterações estruturais significantes por eletromicrografia de transmissão; e embora tenham apresentado aumento de col4a1 (p=0,0056), fsp-1 (p=0,0217) e il-33 (p=0,0132), a razão mmp9/timp1 foi diminuída (p<0,0001), indicando menor acúmulo de matriz extracelular na ausência de nlrp3. Conclusões. Nossos resultados demonstram a participação do inflamassoma NLRP3 no desenvolvimento da GESF experimental, principalmente com a modulação de IL-18 e IL-33. Acreditamos que a ativação do inflamassoma NLRP3 promove extenso dano podocitário ao produzir IL-18, mas, por outro lado, sem o inflamassoma NLRP3, a inativação proteolítica da citocina IL-33 está comprometida contribuindo com o infiltrado celular e aumento de moléculas pró-fibróticas. Assim, a relação GESF e inflamassoma NLRP3 deve ser melhor investigada para direcionar a elaboração de fármacos que atuem precisamente, impedindo a lesão podocitária sem, contudo, comprometer “a vigilância” desse importante componente da imunidade inata.
Introdução. A inflamação crônica está associada a diversas doenças, incluindo a doença renal crônica (DRC), como a glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), uma glomerulopatia em que mecanismos inflamatórios e degenerativos estão associados ao dano podocitário. A GESF é uma doença de difícil tratamento, na qual 50% dos pacientes são resistentes à corticoterapia. Nas últimas duas décadas, o sistema sensor denominado inflamassoma NLRP3 tem sido extensamente estudado, demonstrando sua importante contribuição à resposta imune inata. No entanto, pouco foi explorado sobre a relação GESF e o inflamassoma NLRP3. Objetivos. Assim como ocorre em outras doenças, acreditamos que o inflamassoma NLRP3 também possa contribuir para o desenvolvimento da GESF. Neste sentido, investigamos a participação dos componentes dessa via na GESF experimental a fim de desvendar novos mecanismos da resposta imune na doença renal. Métodos. Através do modelo de nefropatia induzida por Adriamicina (DOX) em animais selvagem, C57BL/6J, mutantes, NLRP3 KO, ASC KO, CASP-1 KO, e transgênicos do Sistema Cre-Lox, avaliamos e comparamos a ativação do inflamassoma NLRP3. Estudamos a função renal e a expressão gênica e proteica de moléculas relacionadas à podocitopatia, a inflamação e reparo tecidual. Resultados. Verificamos que a ativação do inflamassoma NLRP3 acontece precocemente, no segundo dia do modelo, em animais C57BL/6J, com aumento da expressão de nlrp3 (p=0,0275), casp-1 (p=0,0038), pró-il-18 (p<0,0001) e IL-18 sérica (p<0,0001), associado à diminuição expressiva dos genes que codificam as proteínas da estrutura dos podócitos e da fenda do diafragma podocitário, actn4, synpo, nphs1 e kirrel (p<0,0001), além da diminuição do número de podócitos, WT1 (p=0,0009), e, por eletromicrografia de transmissão, apagamento dos pedicelos. Dentre os animais knockouts e transgênicos, destacamos que os animais NLRP3 KO estavam protegidos contra o dano provocado pela DOX, a nível de podócitos, não apresentando diferenças entre os grupos quanto à expressão de moléculas podocitárias (p>0,05) ou alterações estruturais significantes por eletromicrografia de transmissão; e embora tenham apresentado aumento de col4a1 (p=0,0056), fsp-1 (p=0,0217) e il-33 (p=0,0132), a razão mmp9/timp1 foi diminuída (p<0,0001), indicando menor acúmulo de matriz extracelular na ausência de nlrp3. Conclusões. Nossos resultados demonstram a participação do inflamassoma NLRP3 no desenvolvimento da GESF experimental, principalmente com a modulação de IL-18 e IL-33. Acreditamos que a ativação do inflamassoma NLRP3 promove extenso dano podocitário ao produzir IL-18, mas, por outro lado, sem o inflamassoma NLRP3, a inativação proteolítica da citocina IL-33 está comprometida contribuindo com o infiltrado celular e aumento de moléculas pró-fibróticas. Assim, a relação GESF e inflamassoma NLRP3 deve ser melhor investigada para direcionar a elaboração de fármacos que atuem precisamente, impedindo a lesão podocitária sem, contudo, comprometer “a vigilância” desse importante componente da imunidade inata.