Estudo de estrutura-atividade do peptídeo antimicrobiano IsCT1
Data
2020-04-30
Autores
Oliveira, Cyntia Silva De 
Orientadores
Oliveira Junior, Vani Xavier De
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction: The increase in multidrug-resistant bacteria represents a major global health challenge, in this scenario, antimicrobial peptides represents a promising alternative for the development of new drugs due to the broad spectrum or good selectivity. Among them, IsCT1 (ILGKIWEGIKSLF-NH2) obtained from the venom of the scorpion Opisthacanthus madagascariensis, has a potent antimicrobial activity, but high hemolytic activity in human erythrocytes. Objectives: To obtain peptides based on the general structure of IsCT1 with point substitutions of amino acid residues on the hydrophilic, hydrophobic or both faces, in order to verify how these changes and their consequent physicochemical changes reflect on the structure and biological activity. Methodology: The peptides were synthesized in solid phase by the Fmoc strategy, purified by liquid chromatography (HPLC), characterized by mass spectrometry (LCESI/MS). Conformational studies were carried out by circular dichroism (CD) in water and solutions of PBS, SDS, TFE. Hemolytic activity assays were performed using human erythrocytes and the antimicrobial activity was tested against strains of Grampositive and Gram-negative bacteria. Anticancer activity was tested in human breast cancer cells / MCF-7A, and cytotoxicity in human breast epithelial cells / MCF-10A. Results and discussion: The analogs showed a reduction in hemolytic activity, mainly when made substitution of the glutamic acid residue present in position 8 of the IsCT1 peptide, this analogs also showed antimicrobial activity in low concentrations and high therapeutic indexes, except for the analogue An5, which had its load increased to +6 by the insertion of three lysine residues in addition to proline in position 8, its showed a reduction in antimicrobial activity and high hemolytic activity. In turn, An2 showed the best results of antimicrobial activity and absence of hemolytic activity up to the concentration of 128 μmol L-1 . It was also observed the activity against human breast cancer cells presented by IsCT1 and by two of the analogs synthesized with substitution in position 7, adding the proline residue (An2 and An8). A direct relationship between secondary structure and biological activity has not been established, since the analogs showed little tendency to form helix in TFE and varying values in SDS. The peptides were also tested for stability against enzymatic degradation, where an increase in resistance was observed, promoted by the insertion of proline in position 8 and a reduction in resistance, when proline was inserted in position 7. Conclusion: The results obtained show how the modifications of amino acid residues along the peptide sequence promote physical-chemical changes capable of interfering both in biological activity and in peptide stability.
Introdução: O aumento de bactérias multirresistentes representa um grande desafio à saúde global; nesse cenário, os peptídeos antimicrobianos representam uma alternativa promissora para o desenvolvimento de novos medicamentos, devido ao seu amplo espectro e seletividade. Entre eles, o IsCT1 (ILGKIWEGIKSLF-NH2) - obtido a partir do veneno do escorpião Opisthacanthus madagascariensis - apresenta potente atividade antimicrobiana, porém com alta atividade hemolítica nos eritrócitos humanos. Objetivos: Obter peptídeos baseados na estrutura geral do IsCT1 com substituições pontuais de aminoácidos nas faces hidrofílica, hidrofóbica ou ambas, com o intuito de verificar como essas alterações e suas consequentes modificações físico-químicas refletem na estrutura e na atividade biológica. Metodologia: Os peptídeos foram sintetizados pela estratégia Fmoc, em fase sólida, purificados por cromatografia líquida e caracterizados por espectrometria de massas. Estudos conformacionais foram realizados por dicroísmo circular em água e em soluções de PBS, SDS, TFE. Foram conduzidos ensaios de atividade hemolítica - utilizando eritrócitos humanos, atividade antimicrobiana - contra cepas de bactérias Grampositivas e Gram-negativas, assim como ensaios para verificar a atividade anticâncer - em células de câncer de mama humana / MCF-7A, e citotóxica - contra células epiteliais de mama humana / MCF-10A. Resultados e discussão: Os análogos apresentaram redução da atividade hemolítica, principalmente quando realizada substituição do resíduo de ácido glutâmico, presente na posição 8 do peptídeo IsCT1, esses também apresentaram atividade antimicrobiana em baixas concentrações e altos índices terapêuticos, com exceção do análogo An5, que teve sua carga aumentada para +6 pela inserção de três resíduos de lisina além da prolina na posição 8, este apresentou redução da atividade antimicrobiana e alta atividade hemolítica . Por sua vez, o An2, obtido através da modificação em quatro resíduos de aminoácidos, apresentou os melhores resultados de atividade antimicrobiana e ausência de atividade hemolítica até a concentração de 128 μmol L-1 . Foi observada, ainda, a atividade contra células de câncer de mama humano apresentada pelo IsCT1 e por dois dos análogos sintetizados com substituição na posição 7, adicionando-se o resíduo de prolina (An2 e An8). Não foi estabelecida uma relação direta entre estruturação secundária e atividade biológica, uma vez que os análogos apresentaram pouca tendência à formação de hélice em TFE e valores variados em SDS. Os peptídeos foram também testados quanto sua estabilidade contra degradação enzimática, onde foi observado o aumento da resistência, promovido pela inserção de prolina na posição 8 e a redução da resistência, quando a prolina foi inserida na posição 7. Conclusão: Os resultados obtidos mostram como as modificações de resíduos de aminoácidos ao longo da sequência do peptídeo promove alterações físico-químicas capazes de interferir tanto na atividade biológica quanto na estabilidade peptídica.
Introdução: O aumento de bactérias multirresistentes representa um grande desafio à saúde global; nesse cenário, os peptídeos antimicrobianos representam uma alternativa promissora para o desenvolvimento de novos medicamentos, devido ao seu amplo espectro e seletividade. Entre eles, o IsCT1 (ILGKIWEGIKSLF-NH2) - obtido a partir do veneno do escorpião Opisthacanthus madagascariensis - apresenta potente atividade antimicrobiana, porém com alta atividade hemolítica nos eritrócitos humanos. Objetivos: Obter peptídeos baseados na estrutura geral do IsCT1 com substituições pontuais de aminoácidos nas faces hidrofílica, hidrofóbica ou ambas, com o intuito de verificar como essas alterações e suas consequentes modificações físico-químicas refletem na estrutura e na atividade biológica. Metodologia: Os peptídeos foram sintetizados pela estratégia Fmoc, em fase sólida, purificados por cromatografia líquida e caracterizados por espectrometria de massas. Estudos conformacionais foram realizados por dicroísmo circular em água e em soluções de PBS, SDS, TFE. Foram conduzidos ensaios de atividade hemolítica - utilizando eritrócitos humanos, atividade antimicrobiana - contra cepas de bactérias Grampositivas e Gram-negativas, assim como ensaios para verificar a atividade anticâncer - em células de câncer de mama humana / MCF-7A, e citotóxica - contra células epiteliais de mama humana / MCF-10A. Resultados e discussão: Os análogos apresentaram redução da atividade hemolítica, principalmente quando realizada substituição do resíduo de ácido glutâmico, presente na posição 8 do peptídeo IsCT1, esses também apresentaram atividade antimicrobiana em baixas concentrações e altos índices terapêuticos, com exceção do análogo An5, que teve sua carga aumentada para +6 pela inserção de três resíduos de lisina além da prolina na posição 8, este apresentou redução da atividade antimicrobiana e alta atividade hemolítica . Por sua vez, o An2, obtido através da modificação em quatro resíduos de aminoácidos, apresentou os melhores resultados de atividade antimicrobiana e ausência de atividade hemolítica até a concentração de 128 μmol L-1 . Foi observada, ainda, a atividade contra células de câncer de mama humano apresentada pelo IsCT1 e por dois dos análogos sintetizados com substituição na posição 7, adicionando-se o resíduo de prolina (An2 e An8). Não foi estabelecida uma relação direta entre estruturação secundária e atividade biológica, uma vez que os análogos apresentaram pouca tendência à formação de hélice em TFE e valores variados em SDS. Os peptídeos foram também testados quanto sua estabilidade contra degradação enzimática, onde foi observado o aumento da resistência, promovido pela inserção de prolina na posição 8 e a redução da resistência, quando a prolina foi inserida na posição 7. Conclusão: Os resultados obtidos mostram como as modificações de resíduos de aminoácidos ao longo da sequência do peptídeo promove alterações físico-químicas capazes de interferir tanto na atividade biológica quanto na estabilidade peptídica.