Avaliação da integridade funcional de espermatozoides recuperados após processamento seminal por microfluídica
Data
2024-07-03
Autores
Ribeiro, Amanda das Neves 
Orientadores
Lopes, Paula Intasqui
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Objetivo: O fator masculino de infertilidade pode ser uma das razões para que não haja gravidez de forma natural. Quando há necessidade de realização de técnicas de reprodução assistida, a amostra deve ser previamente processada, para remoção do plasma seminal e para seleção de espermatozoides móveis e viáveis. Diferentes técnicas podem ser utilizadas, mas pouco se sabe sobre a qualidade funcional dos espermatozoides recuperados. Por isso, o objetivo deste estudo é analisar e comparar a integridade funcional dos espermatozoides processados por gradiente de densidade descontínuo e por microfluídica. Métodos: Foi realizado um estudo prospectivo que incluiu trinta homens voluntários (n=30), com uma idade média de 29,8 anos, que coletaram sêmen por masturbação. Após a liquefação do sêmen, uma porção do sêmen a fresco foi utilizada para avaliar a integridade funcional dos espermatozoides (integridade acrossômica, usando coloração PNA, atividade mitocondrial, usando ensaio DAB e fragmentação de DNA pelo ensaio cometa alcalino). O volume restante foi, então, dividido igualmente em duas porções, uma utilizada para o gradiente de densidade descontínuo e a outra para o processamento por microfluídica, utilizando o dispositivo Zymot. Após o processamento, os espermatozoides selecionados foram também avaliados quanto à integridade funcional. Os dados foram comparados entre o controle (amostra a fresco), gradiente de densidade descontínuo e Zymot utilizando teste de Friedman para amostras pareadas com post hoc de Conover ou ANOVA de medidas repetidas com post hoc de Bonferroni (p<0,05). Resultados: O processamento por Zymot não levou a nenhuma alteração em relação à integridade do acrossoma dos espermatozoides quando comparado à amostra a fresco, enquanto o gradiente de densidade descontínuo levou à piora dessa variável. Por outro lado, o Zymot melhorou significativamente a atividade mitocondrial dos espermatozoides, quando comparado à amostra a fresco e aos espermatozoides recuperados por gradiente de densidade descontínuo. A fragmentação de DNA espermático não apresentou diferença significativa entre os três tratamentos. Conclusão: O uso do dispositivo de seleção de espermatozoides via microfluídica (Zymot) permite a seleção de espermatozoides com alta atividade mitocondrial, evitando a reação/dano do acrossoma que ocorre durante a centrifugação em gradiente de densidade, porém não demonstra seleção de espermatozoides com menor taxa de fragmentação de DNA.
Objective: Male infertility may be one of the reasons for the absence of natural pregnancy. When there is a need for assisted reproduction techniques, semen must be previously processed, for the removal of seminal plasma and the selection of motile and viable sperm. Different techniques can be used, but little is known regarding the functional quality of selected sperm. Therefore, the aim of this study is to analyze and compare the functional integrity of sperm processed by discontinuous gradient centrifugation and microfluidics. Methods: A prospective study was conducted, including thirty voluntary men (n=30), with an average age of 29.8 years, who collected semen through masturbation. After semen liquefaction, a portion of the raw semen was used to assess sperm functional integrity (acrosomal integrity using PNA staining, mitochondrial activity using the DAB assay, and sperm DNA fragmentation through the alkaline comet assay). The remaining volume was then equally divided into two portions, one processed by discontinuous gradient centrifugation and the other by microfluidics, using the Zymot device. After semen processing, selected sperm were evaluated for their functional integrity. Data were compared between raw semen, density gradient, and Zymot using paired Friedman with Conover post hoc or repeated measures ANOVA with Bonferroni post hoc (p<0.05). Results: Zymot did not lead to any alteration regarding sperm acrosome integrity, when compared to raw semen, whereas discontinuous gradient centrifugation significantly impaired this variable. On the other hand, Zymot led to the improvement of sperm mitochondrial activity, when compared to raw semen and sperm recovered by discontinuous gradient centrifugation. Sperm DNA fragmentation did not show a significant difference between the three treatments. Conclusions: The use of the microfluidic sperm selection device (Zymot) allows for the selection of sperm with high mitochondrial activity, avoiding the acrosome reaction/damage that occurs during density gradient centrifugation. However, it does not demonstrate any improvement in the selection of spermatozoa with lower rates of DNA fragmentation.
Objective: Male infertility may be one of the reasons for the absence of natural pregnancy. When there is a need for assisted reproduction techniques, semen must be previously processed, for the removal of seminal plasma and the selection of motile and viable sperm. Different techniques can be used, but little is known regarding the functional quality of selected sperm. Therefore, the aim of this study is to analyze and compare the functional integrity of sperm processed by discontinuous gradient centrifugation and microfluidics. Methods: A prospective study was conducted, including thirty voluntary men (n=30), with an average age of 29.8 years, who collected semen through masturbation. After semen liquefaction, a portion of the raw semen was used to assess sperm functional integrity (acrosomal integrity using PNA staining, mitochondrial activity using the DAB assay, and sperm DNA fragmentation through the alkaline comet assay). The remaining volume was then equally divided into two portions, one processed by discontinuous gradient centrifugation and the other by microfluidics, using the Zymot device. After semen processing, selected sperm were evaluated for their functional integrity. Data were compared between raw semen, density gradient, and Zymot using paired Friedman with Conover post hoc or repeated measures ANOVA with Bonferroni post hoc (p<0.05). Results: Zymot did not lead to any alteration regarding sperm acrosome integrity, when compared to raw semen, whereas discontinuous gradient centrifugation significantly impaired this variable. On the other hand, Zymot led to the improvement of sperm mitochondrial activity, when compared to raw semen and sperm recovered by discontinuous gradient centrifugation. Sperm DNA fragmentation did not show a significant difference between the three treatments. Conclusions: The use of the microfluidic sperm selection device (Zymot) allows for the selection of sperm with high mitochondrial activity, avoiding the acrosome reaction/damage that occurs during density gradient centrifugation. However, it does not demonstrate any improvement in the selection of spermatozoa with lower rates of DNA fragmentation.
Descrição
Citação
RIBEIRO, Amanda das Neves. Avaliação da integridade funcional de espermatozoides recuperados após processamento seminal por microfluídica. 2024. 55 f. Dissertação (Mestado em Urologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2024.