Análise da expressão dos genes ompF e RecA em Escherichia coli exposta a antimicrobianos e docking molecular para inibidores da recA
Data
2018-12-12
Autores
Silva, Aghata Cardoso da 
Orientadores
Minarini, Luciene Andrade da Rocha
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Some antimicrobial agents, such as ciprofloxacin (CIP), can lead to genetic changes in Escherichia coli by inducing the SOS Response, process in which RecA protein plays an essencial role. In sub-inhibitory concentrations (sub- MIC) of CIP, the expression of genes related to bacterial stress is modulated, benefiting the appearance of drug resistance. Therefore, the aim of this study was to evaluate the impact of sub-MIC of antimicrobial agents can cause in wildtype strains of uropathogenic E. coli resistant to quinolones. Three E. coli were exposed to sub-MICs of CIP and nitrofurantoin (NIT) and the expression of ompF and recA genes was determined by Real-time PCR (RT-PCR). Also, the effect of the sub-MIC exposure was evaluated in solid medium using diskdiffusion assays. Furthermore, a mode of interaction between RecA inhibitors compounds and RecA protein was proposed. Differences of inhibition zone diameters obtained by disk-diffusion were statistically significant: positive average differences (AD) were obtained for JF-234 strain exposed to CIP when tested ertapenem, imipenem, cefoxitin and tigeciclin disks, and to NIT when tested cefoxitin and tigeciclin disks. Negative AD was obtained for U- 79 strain in sub-MIC of CIP and NIT. U-414 strain showed positive AD in sub- MIC of NIT when tested amoxicilin/clavulanic acid, ertapenem and levofloxacin disks. By RT-PCR, an 1,2-4,7-fold increases in recA expression were noted in all E. coli studied. However, the level of ompF expression varied: an 1,16 and 1,41-fold increases in ompF expression was observed in JF-234 and U-414 by exposure to sub-MIC of NIT and CIP, respectively and a 0,72-fold decrease in ompF in JF-234 exposed to CIP and a 0,54 and 0,406-fold decreases to U-79 exposed to CIP and NIT, respectively. Based on these results, it was performed the molecular docking studies with three compounds derived from 2-amino-4,6-diarylpyridine which were reported to inhibit RecA. These studies revealed that the two most active analogs show a binding mode within the site from which it recognizes the ATP cofactor, establishing p-stacking interactions with Tyr103 and hydrogen bonds with Tyr264. The second better analog presented an additional interaction point with Tyr264, through p-stacking forces. It is noteworthy that these compounds presented different conformations in the explored site, but the conformations that presented higher frequencies exhibited fundamentally the same pattern of interactions and binding mode. The worst chosen compound, which presents the lowest IC50 values, but yet some biological activity, showed a similar binding mode, but through only one p-stacking interaction with Tyr103. This kind of interaction is weaker compared with the hydrogen bonds, for instance, and would result in a lower affinity affinity of this compound by the ATP binding site. This fact could, at some extension, explain the lower RecA inhibitory activity reported at literature for this compound. These results, allowed to the establishment of a potencial pharmacophore which may be employed in the search for better inhibitors. These findings suggest, yet, a strategy to inhibit SOS Response controlled by RecA in E. coli that could be useful for the development of new antimicrobial agents.
Alguns antimicrobianos, como o ciprofloxacino (CIP), podem favorecer mudanças genéticas em Escherichia coli por meio de indução da Resposta SOS, processo no qual a proteína RecA desempenha papel essencial. Concentrações sub-inibitórias (sub-CIM) de CIP modulam a expressão de genes relacionados ao estresse bacteriano, favorecendo o aparecimento de resistência bacteriana. Sendo assim, objetivou-se avaliar o impacto que antimicrobianos usados em sub-CIM podem causar em linhagens selvagens de E. coli uropatogênicas resistentes às quinolonas. Três E. coli foram expostas a sub-CIMs de CIP e nitrofurantoína (NIT), e o efeito dessa exposição foi analisado mediante ensaio de disco-difusão e expressão dos genes ompF e recA por PCR em tempo real (RT-PCR). Em adição, por meio de estudos de docking molecular, foi proposto um modo de interação entre compostos inibidores da RecA e essa proteína. O disco-difusão forneceu diferenças de médias (DM) dos halos de inibição estatisticamente significativas, com: DM positivas na linhagem JF-234 exposta a CIP para discos de ertapenem, imipenem, cefoxitina e tigeciclina, e a NIT, para discos de cefoxitina e tigeciclina; DM negativas na cepa U-79 sob sub-CIMs de CIP e NIT; DM positivas na cepa U-414 exposta a NIT para os discos de amoxicilina/ácido clavulânico, ertapenem e levofloxacino. Por meio do RT-PCR, notou-se aumento na expressão de recA nas linhagens de E. coli estudadas: 1,2- 4,7 vezes. Já a expressão de ompF foi variada: aumento de 1,2 e 1,4 vezes para JF-234 e U-414 expostas à NIT e CIP, respectivamente, e diminuição de 0,7 vezes em JF-234 exposta a CIP e de 0,5 e 0,4 vezes para U-79 exposta a CIP e NIT, respectivamente. Frente ao fato de a expressão de RecA estar aumentada nas cepas resistentes, realizaram-se estudos de docking molecular de três compostos derivados da 2-amino-4,6-diarilpiridina que apresentam reconhecido potencial inibitório sobre esta enzima. Estes estudos demonstraram que os dois compostos com melhor atividade biológica reportada na literatura também apresentam um padrão de interação com a enzima no sítio de reconhecimento do ATP, estabelecendo interações do tipo p-stacking com a Tyr103 e ligação de hidrogênio com Tyr264. O segundo melhor composto apresenta, ainda, um ponto adicional de interação do tipo p-stacking com a Tyr264. Notou-se que estes compostos apresentam diferentes conformações no sítio estudado, porém, as de maior frequência apresentam o mesmo padrão de interação. O composto de menor atividade biológica reportada apresentou padrão de interação semelhante ao dos demais, entretanto, com apenas uma interação do tipo p-stacking com a Tyr103. Interações dessa natureza tem menor força, refletindo numa menor afinidade desse composto ao sítio e, consequentemente, explicando a menor atividade observada na literatura. Foi possível estabelecer, assim, os principais pontos de interação destes ligantes com o sítio do ATP que poderiam justificar a ação dos mesmos gerando, consequentemente, um potencial farmacóforo, o qual poderá ser utilizado na busca de novos inibidores. Estes achados sugerem uma estratégia para inibir a Resposta SOS controlada por RecA em E. coli, o que pode ser útil para o desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos.
Alguns antimicrobianos, como o ciprofloxacino (CIP), podem favorecer mudanças genéticas em Escherichia coli por meio de indução da Resposta SOS, processo no qual a proteína RecA desempenha papel essencial. Concentrações sub-inibitórias (sub-CIM) de CIP modulam a expressão de genes relacionados ao estresse bacteriano, favorecendo o aparecimento de resistência bacteriana. Sendo assim, objetivou-se avaliar o impacto que antimicrobianos usados em sub-CIM podem causar em linhagens selvagens de E. coli uropatogênicas resistentes às quinolonas. Três E. coli foram expostas a sub-CIMs de CIP e nitrofurantoína (NIT), e o efeito dessa exposição foi analisado mediante ensaio de disco-difusão e expressão dos genes ompF e recA por PCR em tempo real (RT-PCR). Em adição, por meio de estudos de docking molecular, foi proposto um modo de interação entre compostos inibidores da RecA e essa proteína. O disco-difusão forneceu diferenças de médias (DM) dos halos de inibição estatisticamente significativas, com: DM positivas na linhagem JF-234 exposta a CIP para discos de ertapenem, imipenem, cefoxitina e tigeciclina, e a NIT, para discos de cefoxitina e tigeciclina; DM negativas na cepa U-79 sob sub-CIMs de CIP e NIT; DM positivas na cepa U-414 exposta a NIT para os discos de amoxicilina/ácido clavulânico, ertapenem e levofloxacino. Por meio do RT-PCR, notou-se aumento na expressão de recA nas linhagens de E. coli estudadas: 1,2- 4,7 vezes. Já a expressão de ompF foi variada: aumento de 1,2 e 1,4 vezes para JF-234 e U-414 expostas à NIT e CIP, respectivamente, e diminuição de 0,7 vezes em JF-234 exposta a CIP e de 0,5 e 0,4 vezes para U-79 exposta a CIP e NIT, respectivamente. Frente ao fato de a expressão de RecA estar aumentada nas cepas resistentes, realizaram-se estudos de docking molecular de três compostos derivados da 2-amino-4,6-diarilpiridina que apresentam reconhecido potencial inibitório sobre esta enzima. Estes estudos demonstraram que os dois compostos com melhor atividade biológica reportada na literatura também apresentam um padrão de interação com a enzima no sítio de reconhecimento do ATP, estabelecendo interações do tipo p-stacking com a Tyr103 e ligação de hidrogênio com Tyr264. O segundo melhor composto apresenta, ainda, um ponto adicional de interação do tipo p-stacking com a Tyr264. Notou-se que estes compostos apresentam diferentes conformações no sítio estudado, porém, as de maior frequência apresentam o mesmo padrão de interação. O composto de menor atividade biológica reportada apresentou padrão de interação semelhante ao dos demais, entretanto, com apenas uma interação do tipo p-stacking com a Tyr103. Interações dessa natureza tem menor força, refletindo numa menor afinidade desse composto ao sítio e, consequentemente, explicando a menor atividade observada na literatura. Foi possível estabelecer, assim, os principais pontos de interação destes ligantes com o sítio do ATP que poderiam justificar a ação dos mesmos gerando, consequentemente, um potencial farmacóforo, o qual poderá ser utilizado na busca de novos inibidores. Estes achados sugerem uma estratégia para inibir a Resposta SOS controlada por RecA em E. coli, o que pode ser útil para o desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos.