Modulação do extrato padronizado de Ginkgo biloba na expressao dos receptores NMDA-NR2B e 5HT1A e de astrócitos em diferentes regiões da formação hipocampal doral de ratos submetidos à aquisição da supressão condicionada da resposta lamber
Data
2014-09-25
Autores
Tilger, Myrcea Andressa de Souza 
Orientadores
Cerutti, Suzete Maria
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
The brain’s ability to adapt and change its structure, connectivity and functional properties over time characterizes neural plasticity, which can be investigated using different approaches. Memory formation has been recognized as a stimulant of brain plasticity, which is often characterized by neuronal and glial adaptations. Our group has been evaluated neural plasticity by means of the analysis of behavioural and morphological correlates. The present study investigated the astroglial reaction employing glial fibrillary acidic protein immunohistochemistry (GFAP-IR) in the hippocampal formation. (CA1, CA3 and GD) with one dose before fear conditioning of EGb (250 mg.Kg-1, 500 mg.Kg-1 and 1000 mg.Kg-1),vehicle (Tween® and Saline), agonists (10.0mg.Kg-1 Buspirone or 10mg.Kg-1N-methyl D-aspartate), antagonists (0.3 mg.Kg-1 (S)-WAY 100135 or 3.0 mg.Kg-1Ro25-6981) of the 5-HT1ARs or NMDARs/GluN2B and antagonists+EGb ((S)-WAY+EGb or Ro+EGb) (n=3/group). Further, negative control groups (saline 0.9% i.p. and Tween 80 12% v.o.), no-footshock group (CS) and conditioned group (CS-US association) were used. Twenty-four hours after the behavioral experiments were performed, the rats (n=3/group) were deeply anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde. After decapitation, the brains were removed, post fixed, cryoprotected in 10% sucrose, frozen and stored at -80ºC until use. Adjacent serial 20-µm-thick coronal brain sections were obtained with a cryostat and mounted on gelatin-coated slices. These sections integrated two levels including formation hippocampal rostral and caudal (coordinates -2.04 to-4.20 mm from bregma). At each region, 4 fields were analyzed bilaterally. Images were acquired using AxioVision software (Carl Zeiss, Axion imager A2). ImageJ software was employed for quantification of the immunoreactive labeling in CA1, CA3 and GD. An increased number of GFAP-IR astrocytes were found in the CA1, CA3 and GD (P<0.05) of the EGb groups. GFAP-IR was increased in the CA3 and GD in Buspirone group (P<0.05). However, no significant changes were observed to NMDA groups (P>0.05). Additionally, the overexpression of GFAP was reversed by treatment with (S)-WAY 100135 or Ro25-6981 prior EGb. Our results provide further evidence that astroglial reaction in the hippocampal formation may be involved in neuroplastic response in those regions. The fear memory/treatment-dependent changes suggest that EGb might be effective for memory enhancement through its effect on the astrocytes cells which seems to be modulate by NMDA-type of glutamate as well as by serotoninergic-type5HT1A receptors.
Existem relatos de diversas aplicações para o uso do extrato padronizado de Ginkgo biloba (EGb). Estudos anteriores evidenciaram que o EGb é capaz de modificar a supressão da resposta emocional condicionada (REC) e a expressão de genes e proteínas no hipocampo de ratos. Entretanto, a compreensão dos fenômenos associados à memória e aos efeitos do EGb requer a análise de sistemas de neurotransmissão. Neste sentido, este estudo avaliou alterações celulares no hipocampo de ratos submetidos ao teste da REC. O modelo utilizado neste estudo possibilita a análise do processo de aprendizagem associativa ao mesmo tempo em que avalia a ansiedade e, é utilizado por se aproximar das respostas de medo em humanos. A aquisição do medo condicionado inclui a participação dos receptores do tipo NMDA e 5HT1A e pode ocorrer em neurônios ou astrócitos. A análise da expressão dos receptores NMDA (subunidade NR2B), 5HT1A e da proteína ácida fibrilar glial (GFAP), característica de astrócitos, nas diferentes regiões da formação hipocampal (CA1, CA3 e GD), por meio da técnica de imunohistoquímica, foi realizada para esclarecer os efeitos observados previamente pelo grupo nas análises comportamentais. Para as análises foram utilizados os encéfalos de ratos Wistar adultos de 18 grupos, a saber: Manipulado (não foi submetido ao teste da REC), submetidos ao teste da REC grupos CS e Aprendizagem (controles da aprendizagem), ao tratamento com EGb (250 mg.Kg-1, 500 mg.Kg-1, 1000 mg.Kg-1), Ro 25-6981 (antagonista) e NMDA (agonista) dos receptores NMDA, (S)-WAY 100135 (antagonista) e Buspirona (agonista) dos receptores 5HT1A, Tween® 80 12% e Salina 0,9% (veículos das drogas), Ro 25-6981+EGb (3 doses) e (S)-WAY 100135+EGb (3 doses). Ao final dos procedimentos experimentais os animais foram perfundidos com de formalina 4% (PBS 0.1 M pH 7,4), os encéfalos foram removidos, congelados e armazenados -80ºC. As lâminas contendo os cortes rostro-caudal (20 μm), obtidos em criostato, foram submetidas ao processamento imunohitoquímico utilizando o anticorpo anti-NR2B, anti-5HT1A ou anti-GFAP. Os dados mostram que: (i) a expressão de GFAP, indicadora de astrogliose, está relacionada com a aprendizagem e é intensificada pelo tratamento com EGb, (ii) a aprendizagem modula a expressão dos receptores NR2B e 5HT1A, (iii) o efeito do EGb na expressão de NR2B foi revertido nos grupos tratados com Ro 25-6981+EGb e (S)WAY 100135+EGb, e (iv) o efeito do EGb na expressão de 5HT1A é mais intenso na dose de 250 mg.Kg-1 e é revertido pelo tratamento com Ro 25-6981. Diante disso, podemos concluir que a aprendizagem da supressão condicionada é modulada pela via glutamatérgica e serotoninérgica com a participação de astrócitos, o tratamento com EGb não prejudicou a aquisição da supressão de REC, e possivelmente possui efeito agonista aos receptores NMDA e 5HT1A, sugerindo interação entre os sistemas de neurotransmissão.
Existem relatos de diversas aplicações para o uso do extrato padronizado de Ginkgo biloba (EGb). Estudos anteriores evidenciaram que o EGb é capaz de modificar a supressão da resposta emocional condicionada (REC) e a expressão de genes e proteínas no hipocampo de ratos. Entretanto, a compreensão dos fenômenos associados à memória e aos efeitos do EGb requer a análise de sistemas de neurotransmissão. Neste sentido, este estudo avaliou alterações celulares no hipocampo de ratos submetidos ao teste da REC. O modelo utilizado neste estudo possibilita a análise do processo de aprendizagem associativa ao mesmo tempo em que avalia a ansiedade e, é utilizado por se aproximar das respostas de medo em humanos. A aquisição do medo condicionado inclui a participação dos receptores do tipo NMDA e 5HT1A e pode ocorrer em neurônios ou astrócitos. A análise da expressão dos receptores NMDA (subunidade NR2B), 5HT1A e da proteína ácida fibrilar glial (GFAP), característica de astrócitos, nas diferentes regiões da formação hipocampal (CA1, CA3 e GD), por meio da técnica de imunohistoquímica, foi realizada para esclarecer os efeitos observados previamente pelo grupo nas análises comportamentais. Para as análises foram utilizados os encéfalos de ratos Wistar adultos de 18 grupos, a saber: Manipulado (não foi submetido ao teste da REC), submetidos ao teste da REC grupos CS e Aprendizagem (controles da aprendizagem), ao tratamento com EGb (250 mg.Kg-1, 500 mg.Kg-1, 1000 mg.Kg-1), Ro 25-6981 (antagonista) e NMDA (agonista) dos receptores NMDA, (S)-WAY 100135 (antagonista) e Buspirona (agonista) dos receptores 5HT1A, Tween® 80 12% e Salina 0,9% (veículos das drogas), Ro 25-6981+EGb (3 doses) e (S)-WAY 100135+EGb (3 doses). Ao final dos procedimentos experimentais os animais foram perfundidos com de formalina 4% (PBS 0.1 M pH 7,4), os encéfalos foram removidos, congelados e armazenados -80ºC. As lâminas contendo os cortes rostro-caudal (20 μm), obtidos em criostato, foram submetidas ao processamento imunohitoquímico utilizando o anticorpo anti-NR2B, anti-5HT1A ou anti-GFAP. Os dados mostram que: (i) a expressão de GFAP, indicadora de astrogliose, está relacionada com a aprendizagem e é intensificada pelo tratamento com EGb, (ii) a aprendizagem modula a expressão dos receptores NR2B e 5HT1A, (iii) o efeito do EGb na expressão de NR2B foi revertido nos grupos tratados com Ro 25-6981+EGb e (S)WAY 100135+EGb, e (iv) o efeito do EGb na expressão de 5HT1A é mais intenso na dose de 250 mg.Kg-1 e é revertido pelo tratamento com Ro 25-6981. Diante disso, podemos concluir que a aprendizagem da supressão condicionada é modulada pela via glutamatérgica e serotoninérgica com a participação de astrócitos, o tratamento com EGb não prejudicou a aquisição da supressão de REC, e possivelmente possui efeito agonista aos receptores NMDA e 5HT1A, sugerindo interação entre os sistemas de neurotransmissão.
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TILGER, Myrcea Andressa de Souza. Modulação do extrato padronizado de ginkgo biloba na expressao dos receptores nmda-nr2b e 5ht1a e de astrócitos em diferentes regiões da formação hipocampal doral de ratos submetidos á aquisição da supressão condicionada da resposta lamber. 2014. 82 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Diadema, 2014.