Detecção de anticorpos contra o receptor de acetilcolina: avaliação de métodos comerciais e construção de um ensaio baseado em células
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Data
2024-04-15
Autores
Santos, Larissa Diogenes [UNIFESP]
Orientadores
Keppeke, Gerson Dierley [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Introdução: A Myasthenia gravis (MG) é uma doença autoimune caracterizada por autoanticorpos patogênicos que reagem contra os receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR), interrompendo a comunicação neuromuscular. O ensaio de Radioimunoprecipitação (RIPA) é recomendado para detectar autoanticorpos contra AChR, mas sua complexidade e uso de materiais radioativos limitam seu uso. Objetivos: 1- avaliar o desempenho de diferentes metodologias comerciais de detecção de reatividade anti-nAChR, incluindo um novo ensaio baseado em células (CBA) e dois kits de ELISA, em relação ao padrão ouro RIPA. 2- o objetivo secundário consistiu no desenvolvimento in house de um ensaio para a detecção de anti-nAChR. Métodos: Foram incluídas 145 amostras com indicação médica para avaliação de reatividade anti-AChR. Kits comerciais: RIPA, ELISA indireto, ELISA competitivo, e um CBA com células fixadas (CBA-F). Para o CBA in house, uma linhagem celular HEK293T que expressa o receptor AChR completo (genes de camundongo) em sua superfície de maneira estável (HEK293T-mAChR) foi construída. As células ainda vivas foram utilizadas como substrato para uma reação de imunomarcação, usando como sonda primária as amostras, recebendo o nome de CBA-L (live cells). Resultados: Pelo método RIPA, 63 foram negativas (RIPA-Neg <0,02 nmol/L), 18 foram classificadas como Borderline (≥0,02 – 1 nmol/L) e 64 foram positivas (RIPAPos >1 nmol/L). O ELISA competitivo mostrou baixa concordância com o RIPA (Kappa = 0,216), tornando este kit específico inviável para aplicação clínica. O ELISA indireto demonstrou concordância substancial (Kappa = 0,652) com RIPA, além de sensibilidade de 76,9% e especificidade de 94% para diagnóstico de MG. O biochip CBA-F comercial, onde células fixadas expressando AChR agrupado pela rapsina foram usadas como substrato, exibiu os melhores resultados, concordância quase perfeita com o RIPA (Kappa = 0,984), com sensibilidade de 98,1% e especificidade de 96,7% para diagnóstico de MG. Além disso, uma análise semiquantitativa mostrou uma forte correlação entre a titulação por diluição seriada no CBA-F, o ELISA indireto e os níveis obtidos pelo RIPA (r=0,793 e r=0,789, respectivamente). Para o CBA-L desenvolvido in house, a estratégia de análise por citômetro de fluxo e baseado na intensidade média de fluorescência resultou em desempenho inferior ao esperado, com concordância razoável com o RIPA (Kappa = 0,281). A especificidade do CBA-L para MG foi de 93%, porém em detrimento da sensibilidade de apenas 35%. Conclusões: O CBA-F comercial apresentou excelente desempenho analítico para diagnóstico de MG e em comparação com o RIPA, tornando-o um potencial substituto para o RIPA em laboratórios clínicos. Alguns ensaios em fase sólida (como o ELISA indireto aplicado aqui), assim como a titulação do CBA-F por diluições seriadas, oferecem opções confiáveis para estimar os níveis de autoanticorpos anti-AChR após a confirmação da positividade pelo CBA-F.
Introduction: Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease characterized by pathogenic autoantibodies that react against nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), disrupting neuromuscular communication. The Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) is recommended to detect autoantibodies against AChR, but its complexity and use of radioactive materials limit its application. Objectives: 1- Evaluate the performance of different commercial methodologies for detecting anti-nAChR reactivity, including a new Cell-Based Assay (CBA) and two ELISA kits, in relation to the gold standard RIPA. 2- The secondary objective consisted of developing an in-house assay for the detection of anti-nAChR. Methods: 145 samples with a medical indication for AChR reactivity assessment were included. Commercial kits were: RIPA, indirect ELISA, competitive ELISA, and a CBA with fixed cells (CBA-F). For the in-house CBA, a HEK293T cell line expressing the full mAChR receptor (mouse genes) on its surface in a stable manner (HEK293T-mAChR) was constructed. Live cells (CBA-L) were used as a substrate for an immunostaining reaction using the samples as the primary probe. Results: By the RIPA method, 63 were negative (RIPA-Neg <0.02 nmol/L), 18 were classified as Borderline (≥0.02 – 1 nmol/L), and 64 were positive (RIPA-Pos >1 nmol/L). The competitive ELISA showed low agreement with the RIPA (Kappa = 0.216), rendering this specific kit unfeasible for clinical application. The indirect ELISA demonstrated substantial agreement (Kappa = 0.652) with RIPA, along with a sensitivity of 76.9% and specificity of 94% for MG diagnosis. The commercial CBA-F biochip, where fixed cells expressing clustered AChR by rapsyn were used as substrate, exhibited the best results, nearly perfect agreement with the RIPA (Kappa = 0.984), and a sensitivity of 98.1% and specificity of 96.7% for MG diagnosis. Furthermore, a semi-quantitative analysis showed a strong correlation between the titration of the CBA-F, the levels by indirect ELISA, and those obtained by the RIPA (r=0.793 and r=0.789, respectively). For the in-house developed CBA-L, the flow cytometry-based analysis strategy using the mean fluorescence intensity resulted in lower-than-expected performance, with reasonable agreement with the RIPA (Kappa = 0.281). The specificity of CBA-L for MG was 93%, but at the expense of sensitivity of only 35%. Conclusions: The commercial CBA-F showed excellent analytical performance for MG diagnostics and in comparison, with RIPA, making it a potential substitute for RIPA in clinical laboratories. Some solid-phase assays (such as the indirect ELISA applied here), as well as CBA-F titration by serial dilutions, offer reliable options to estimate anti-nAChR autoantibody levels after confirming positivity by the CBA-F.
Introduction: Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease characterized by pathogenic autoantibodies that react against nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), disrupting neuromuscular communication. The Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) is recommended to detect autoantibodies against AChR, but its complexity and use of radioactive materials limit its application. Objectives: 1- Evaluate the performance of different commercial methodologies for detecting anti-nAChR reactivity, including a new Cell-Based Assay (CBA) and two ELISA kits, in relation to the gold standard RIPA. 2- The secondary objective consisted of developing an in-house assay for the detection of anti-nAChR. Methods: 145 samples with a medical indication for AChR reactivity assessment were included. Commercial kits were: RIPA, indirect ELISA, competitive ELISA, and a CBA with fixed cells (CBA-F). For the in-house CBA, a HEK293T cell line expressing the full mAChR receptor (mouse genes) on its surface in a stable manner (HEK293T-mAChR) was constructed. Live cells (CBA-L) were used as a substrate for an immunostaining reaction using the samples as the primary probe. Results: By the RIPA method, 63 were negative (RIPA-Neg <0.02 nmol/L), 18 were classified as Borderline (≥0.02 – 1 nmol/L), and 64 were positive (RIPA-Pos >1 nmol/L). The competitive ELISA showed low agreement with the RIPA (Kappa = 0.216), rendering this specific kit unfeasible for clinical application. The indirect ELISA demonstrated substantial agreement (Kappa = 0.652) with RIPA, along with a sensitivity of 76.9% and specificity of 94% for MG diagnosis. The commercial CBA-F biochip, where fixed cells expressing clustered AChR by rapsyn were used as substrate, exhibited the best results, nearly perfect agreement with the RIPA (Kappa = 0.984), and a sensitivity of 98.1% and specificity of 96.7% for MG diagnosis. Furthermore, a semi-quantitative analysis showed a strong correlation between the titration of the CBA-F, the levels by indirect ELISA, and those obtained by the RIPA (r=0.793 and r=0.789, respectively). For the in-house developed CBA-L, the flow cytometry-based analysis strategy using the mean fluorescence intensity resulted in lower-than-expected performance, with reasonable agreement with the RIPA (Kappa = 0.281). The specificity of CBA-L for MG was 93%, but at the expense of sensitivity of only 35%. Conclusions: The commercial CBA-F showed excellent analytical performance for MG diagnostics and in comparison, with RIPA, making it a potential substitute for RIPA in clinical laboratories. Some solid-phase assays (such as the indirect ELISA applied here), as well as CBA-F titration by serial dilutions, offer reliable options to estimate anti-nAChR autoantibody levels after confirming positivity by the CBA-F.
Descrição
Citação
DIOGENES. S, L. Detecção de anticorpos contra o receptor de acetilcolina: avaliação de métodos comerciais e construção de um ensaio baseado em células. 2024. 71 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde aplicadas à Reumatologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2024.