Prospecção de compostos químicos terapêuticos com potencial inibitório do exoproteoma de Acanthamoeba spp
Data
2016-12-21
Autores
Marujo, Fabio Iglesias 
Orientadores
Carvalho, Fabio Ramos de Souza
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction: Acanthamoeba keratitis has presented an increased incidence and ocular morbidity indexes. During pathogenesis, corneal invasion of the amoeba is obtained by the secretion of an exoproteome, which include enzymes believed to be its main virulence factors. Treatment should be started as soon as possible and last for a long period, but the specific therapeutic regimen still lacks a consensus. The use of low doses of antiamoebic medications as proteolysis inhibitors may be a new and promising form of treatment, in which the focus is stopping the pathological process, rather than just attacking the microorganism itself. Materials and Methods: A sterile 96 well assay black plate was used to dilute one antiamoebic drug, exoproteome, EnzChek® Gelatinase/Collagenase Assay Kit substrate and reaction buffer in each well. Four different concentrations of each drug (Polyhexamethylene biguanide, Chlorhexidine gluconate, Hexamidine di-isethionate and Propamidine Isethionate) were tested in exoproteome from four different strains of Acanthamoeba. A second assay consisted in evaluating toxicity in commercially available certified standard cell lines of corneal keratocytes (SIRC) exposed to different dosages of PHMB, chlorhexidine, hexamidine and propamidine in the presence and absence of exoproteom. For this, PrestoBlue® Cell Viability Reagent was used. All assays used saline solution (NaCl 0.9%) as solvent and were conducted in triplicate. Fluorescence readings were performed by SpectraMax® Paradigm® Multi-Mode Detection Platform. Results: All compounds reduced proteolysis and there was a clear correlation between the concentration of the drug and its inhibitory effect, which was more pronounced in higher concentrations of hexamidine, propamidine and chlorhexidine. However the opposite occurred with PHMB, with concentrations as low as 0.0025% having a powerful inhibitory effect compared to the null effect of 0.02%. Regarding the SIRC keratocytes assay all drugs tested caused a decrease in cell viability, which was directly proportional to its concentration, both in the presence or absence of exoproteome. Discussion and conclusion: The formation of micelles of PHMB may be responsible for the decrease in its inhibitory effect in high concentrations. Therefore, a high concentration of antiamoebic drugs does not necessarily improve the clinical outcome, not only by the increase of citotoxicity, but also by lowering the inhibitory effect it would have on proteolisis. Studies using low-concentration PHMB in Acanthamoeba keratitis should be conducted to establish the most effective dosage in those cases.
Introdução: Ceratite por Acanthamoeba tem apresentado um aumento em sua incidência e morbidade ocular nos últimos tempos. Sua patogênese envolve a invasão corneana pela ameba, a qual é obtida pela secreção de um exoproteoma, que contém enzimas às quais se atribui a virulência da infecção. O tratamento deve ser iniciado o mais cedo possível e durar um longo período de tempo, porém não há consenso quanto ao esquema específico de tratamento. O uso de baixas doses de drogas amebicidas como inibidores da proteólise podem ser uma nova e promissora forma de tratamento, em que o foco é a parada do processo patológico, e não apenas o ataque ao microrganismo em si. Materiais e Métodos: Uma placa estéril preta de 96 poços foi usada para diluir uma droga amebicida, exoproteoma, substrato do kit (EnzCheck® Gelatinase/Collagenase Assay Kit) e solução tampão em cada poço. Quatro concentrações diferentes de cada medicamento (Polihexametileno biguanida catiônica (PHMB), Gluconato de clorexidina, Diisetionato de Hexamidina e Isotionato de Propamidina) foram testadas com exoproteomas de quatro cepas diferentes de Acanthamoeba. Um segundo experimento consistiu na avaliação da toxicidade em linhagem padrão certificada de ceratócitos (SIRC) expostas a diferentes doses de PHMB, clorexidina, hexamidina e propamidina na presença e na ausência de exoproteoma. Para tal, foi usado o reagente de viabilidade celular PrestoBlue®. Todos os experimentos utilizaram solução salina (NaCl 0.9%) como solvente e foram conduzidos em triplicata. Leituras de fluorescência foram realizadas pela plataforma de detecção SpectraMax® Paradigm® Multi-Mode. Resultados: Todos os compostos reduziram a proteólise e houve uma clara correlação entre a concentração da droga e seu efeito inibitório, o qual foi mais pronunciado nas altas concentrações de hexamidina, propamidina e clorexidina. Contudo, o oposto ocorreu com o PHMB, que registrou uma menor proteólise na presença das concentrações mais baixas. A respeito do experimento com os ceratócitos SIRC, todas as drogas testadas mostraram uma queda da viabilidade celular, proporcional à concentração usada, tanto na presença quanto na ausência de exoproteoma. Discussão e Conclusão: A formação de micelas de PHMB pode ser a responsável pela queda da sua atividade inibitória nas altas concentrações. Dessa forma, maiores concentrações de drogas amebicidas podem não melhorar o desfecho clínico dos pacientes e, não só aumentar a citotoxicidade, mas também diminuir o efeito inibitório que a medicação teria na proteólise. Estudos usando baixas doses de PHMB em ceratite por Acanthamoeba precisam ser conduzidos para estabelecer a dose mais efetiva nesses casos.
Introdução: Ceratite por Acanthamoeba tem apresentado um aumento em sua incidência e morbidade ocular nos últimos tempos. Sua patogênese envolve a invasão corneana pela ameba, a qual é obtida pela secreção de um exoproteoma, que contém enzimas às quais se atribui a virulência da infecção. O tratamento deve ser iniciado o mais cedo possível e durar um longo período de tempo, porém não há consenso quanto ao esquema específico de tratamento. O uso de baixas doses de drogas amebicidas como inibidores da proteólise podem ser uma nova e promissora forma de tratamento, em que o foco é a parada do processo patológico, e não apenas o ataque ao microrganismo em si. Materiais e Métodos: Uma placa estéril preta de 96 poços foi usada para diluir uma droga amebicida, exoproteoma, substrato do kit (EnzCheck® Gelatinase/Collagenase Assay Kit) e solução tampão em cada poço. Quatro concentrações diferentes de cada medicamento (Polihexametileno biguanida catiônica (PHMB), Gluconato de clorexidina, Diisetionato de Hexamidina e Isotionato de Propamidina) foram testadas com exoproteomas de quatro cepas diferentes de Acanthamoeba. Um segundo experimento consistiu na avaliação da toxicidade em linhagem padrão certificada de ceratócitos (SIRC) expostas a diferentes doses de PHMB, clorexidina, hexamidina e propamidina na presença e na ausência de exoproteoma. Para tal, foi usado o reagente de viabilidade celular PrestoBlue®. Todos os experimentos utilizaram solução salina (NaCl 0.9%) como solvente e foram conduzidos em triplicata. Leituras de fluorescência foram realizadas pela plataforma de detecção SpectraMax® Paradigm® Multi-Mode. Resultados: Todos os compostos reduziram a proteólise e houve uma clara correlação entre a concentração da droga e seu efeito inibitório, o qual foi mais pronunciado nas altas concentrações de hexamidina, propamidina e clorexidina. Contudo, o oposto ocorreu com o PHMB, que registrou uma menor proteólise na presença das concentrações mais baixas. A respeito do experimento com os ceratócitos SIRC, todas as drogas testadas mostraram uma queda da viabilidade celular, proporcional à concentração usada, tanto na presença quanto na ausência de exoproteoma. Discussão e Conclusão: A formação de micelas de PHMB pode ser a responsável pela queda da sua atividade inibitória nas altas concentrações. Dessa forma, maiores concentrações de drogas amebicidas podem não melhorar o desfecho clínico dos pacientes e, não só aumentar a citotoxicidade, mas também diminuir o efeito inibitório que a medicação teria na proteólise. Estudos usando baixas doses de PHMB em ceratite por Acanthamoeba precisam ser conduzidos para estabelecer a dose mais efetiva nesses casos.
Descrição
Citação
MARUJO, Fabio Iglesias. Prospecção de compostos químicos terapêuticos com potencial inibitório do exoproteoma de Acanthamoeba spp. 2016. 50 f. Dissertação (Mestrado Profissional em Tecnologia, Gestão e Saúde Ocular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.