Caracterização genômica e estrutural das proteínas KKT ("Kinetoplastid KineTochore") de Trypanosoma cruzi

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dc.audience.educationlevelMestrado
dc.contributor.advisorSilveira Filho, Jose Franco Da [UNIFESP]
dc.contributor.advisor-coSouza, Renata Torres de [UNIFESP]
dc.contributor.advisor-coLatteshttp://lattes.cnpq.br/4061553673291316
dc.contributor.advisorLatteshttp://lattes.cnpq.br/8810765839775059
dc.contributor.authorCardoso, Thais De Oliveira [UNIFESP]
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/5984115544617190
dc.contributor.institutionUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)pt_BR
dc.coverage.spatialSão Paulo
dc.date.accessioned2021-01-19T16:31:59Z
dc.date.available2021-01-19T16:31:59Z
dc.date.issued2019-11-28
dc.description.abstractCell division and the correct transmission of genetic material are essential for the survival of the living being. Many proteins ensure the accuracy and timing of these events by blocking changes that could result in damage to the cell. Proteins from DNA replication machinery are shared among eukaryotes, while the molecules involved in chromosomal segregation show sequence divergence. The identification in trypanosomes of centromeric and kinetochore proteins is hampered by the divergence between the primary sequence of these proteins from those of other eukaryotes. Recently, twenty Trypanosoma brucei kinetochore proteins were identified by mass spectrometry in the proteinassociated complexes whose transcripts increased during the cell cycle. The presence in Trypanosoma cruzi of KKT orthologous proteins (“Kinetoplastid KineTochore protein”) suggests their participation in the parasite's cell division. We analyzed the genomic organization in KKT9 orthologous and the presence of functional domains predicted by analysis of the primary amino acid sequence and structural motifs. Most KKT proteins are encoded by a pair of alleles, and also hemizigosis was detected in the clone CLB. The exception was the KKT11 protein which is encoded by five duplicate genes, distributed on four chromosomes, perhaps by retrotransposition. The low similarity among most KKT proteins is related to the origin and function of these proteins. KKT proteins have different origins and have been selected to act in the same biological process. The presence of conserved domains suggests that T. cruzi KKT proteins may be involved in important cell cycle steps and chromosomal segregation and have functions similar to those described in T. brucei. Experimental analyses will be needed to confirm these predictions. KKT9 protein was selected for more detailed structural and functional characterization in T. cruzi. The KKT9 is made up of a long and a short α-helix chains, connected together by a random-coil and turn handle region, forming a V-like shaped structure. Bioinformatics analyses found similarity between a region of KKT9 protein and the SMC proteins involved in the chromosomal condensation and sister chromatids cohesion during metaphase. In addition, the three-dimensional structure of KKT9 was aligned with the structures of two proteins important for the eukaryotic cell cycle (S. cerevisiae SMC and S. pombe septation protein-cdc11). The KKT9 gene was cloned into pGEX-1λT expression vector and the recombinant protein expressed in a heterologous system for antiboby production in mice. Polyclonal anti-KKT9 antibodies were used in western blotting analysis of expression of KKT9 protein throughout the cell cycle. We observed increased of the level of KKT9 protein in the S and G2 / M phases. Taken together data suggest the participation of KKT9 in T. cruzi chromosomal segregation.en
dc.description.abstractA divisão celular e a correta transmissão do material genético são essenciais para a sobrevivência do ser vivo. Várias proteínas garantem a precisão e sincronia desses eventos bloqueando alterações que possam resultar em danos ao organismo. As proteínas da maquinaria de replicação do DNA são compartilhadas entre diversos eucariotos, enquanto as moléculas envolvidas na segregação cromossômica apresentam grande divergência em sequência. A identificação de proteínas centroméricas e de cinetócoro em tripanossomas é dificultada pela divergência entre a sequência primária destas proteínas com as de outros eucariotos. Recentemente, 20 proteínas de cinetócoro de Trypanosoma brucei foram identificadas por espectrometria de massa em complexos associados às proteínas cujos transcritos tiveram seu nível aumentado durante o ciclo celular. A presença em Trypanosoma cruzi de proteínas ortólogas KKT (“Kinetoplastid KineTochore protein”) sugere a participação destas na divisão celular do parasita. Nós analisamos a organização genômica dos genes ortólogos KKT de T. cruzi e a presença de domínios funcionais preditos tanto pela análise da sequência linear (sequência de aminoácidos) como pela análise estrutural. A maioria das proteínas KKT são codificadas por um par de alelos, com alguns casos de hemizigose no clone CLB. A única exceção foi a proteína KKT11 que é codificada por 5 genes duplicados, distribuídos em vários cromossomos, talvez, por retrotransposição. A baixa similaridade existente entre a maioria das proteínas KKT está relacionada com a origem e função destas proteínas. As proteínas KKT tem diferentes origens e foram selecionadas para atuarem em um mesmo processo biológico. A presença de domínios conservados sugere que as proteínas KKT de T. cruzi podem estar envolvidas em passos importantes do ciclo celular e segregação cromossômica e que apresentem funções semelhantes às descritas em T. brucei. Análises experimentais serão necessárias para confirmar essas predições. A proteína KKT9 foi selecionada para caracterização estrutural e funcional mais detalhada em T. cruzi. A estrutura da KKT9 é composta por cadeias de αhélice, uma longa e outra mais curta, conectadas entre si por uma alça de estrutura não-organizada (“random-coil” e “turn”), formando uma estrutura em V. Análises de bioinformática encontraram similaridade entre uma região da proteína KKT9 e as proteínas SMC envolvidas na condensação cromossômica e coesão das cromátides irmãs durante a metáfase. Além disso foi feito o alinhamento da estrutura tridimensional da KKT9 com as estruturas de duas proteínas importantes para o ciclo celular de eucariotos (SMC de S. cerevisiae e proteína de septação de S. pombe-cdc11). O gene KKT9 foi clonado em vetor de expressão pGEX-1λT e a proteína recombinante expressa em um sistema heterólogo pra produção de anticorpos em camundongos. Anticorpos policlonais anti-KKT9 foram utilizados para análise por “western blotting” da expressão da proteína KKT9 nativa ao longo do ciclo celular. Observamos aumento do nível da proteína KKT9 nas fases S e G2/M. Em conjunto estes dados sugerem a participação da KKT9 na segregação cromossômica de T. cruzi.pt_BR
dc.description.sourceDados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2019)
dc.format.extent127 f.
dc.identifierhttps://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=8306064pt_BR
dc.identifier.citationCARDOSO, Thaís de Oliveira. Caracterização genômica e estrutural das proteínas KKT (“Kinetoplastid KineTochore”) de Trypanosoma cruzi. 2019. 122f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia e Imunologia) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.
dc.identifier.fileThaís de Oliveira Cardoso-A.pdf
dc.identifier.urihttps://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59238
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.subjectTrypanosoma Cruzien
dc.subjectProteinassociateden
dc.subjectProteins From Dnaen
dc.subjectProteínas De Ciclo Celularpt_BR
dc.subjectTrypanosoma Cruzipt_BR
dc.subjectBioinformáticapt_BR
dc.titleCaracterização genômica e estrutural das proteínas KKT ("Kinetoplastid KineTochore") de Trypanosoma cruzipt_BR
dc.title.alternativeGenomic and structural characterization of Trypanosoma Cruzi KKT(Kinetoplastid Kine Tochore) proteinsen
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/masterThesis
unifesp.campusSão Paulo, Escola Paulista de Medicinapt_BR
unifesp.graduateProgramMicrobiologia e Imunologiapt_BR
unifesp.knowledgeAreaBiologia Celularpt_BR
unifesp.researchAreaEstudos De Biologia Celular, Sinalização, Mecanismos De Patogenicidade E Fatores De Virulência Em Patógenos Humanos (Vírus, Bactérias, Fungos E Tripanosomatídeos) E No Cancerpt_BR
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