Importância da tiorredoxina-1 nos efeitos citotóxicos diferenciais dos s-nitrosotióis-aril-butanamidas sobre linhagens celulares humanas normais e de carcinoma mamário
Data
2019-02-28
Autores
Fugimoto, Mariana 
Orientadores
Monteiro, Hugo Pequeno
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Female breast cancer is the one that affects most women worldwide, and it is classified according to the estrogen receptor (ER) expression, with ER- tumors being more aggressive and having worse prognosis. Nitric oxide (NO) is a gaseous free radical produced by organisms distributed through all phyla, acting as a signaling mediator in various cell types. NO-mediated cellular signaling occurs through post-translational modifications in proteins, responsible for physiological as well as pathological mechanisms. The manipulation of endogenous NO concentrations through administration of NO donors would be an interesting and viable method of therapy, with unexplored therapeutic potential. In physiological conditions, cells remain in a reducing environment, and its redox balance is maintained by antioxidant systems, such as the Thioredoxin-1 system (Trx-1), which has been shown to be overexpressed in several cancers and associated with aggressive tumor growth, resistance to conventional therapies, and decreased survival rates. Trx-1 is an appropriate molecular target for the study of the regulation of these processes, as well as in the development of new compounds that aim to alter the availability of this protein and of cell oxidants that may alter the cellular environment. Purpose: The objective of this study was to test the susceptibility of different cell lines to concentrations of S-nitrosothiols ortho and meta-chloro-SNOKs, in order to characterize them as compounds with antitumor activity that would exert their cytotoxic action preferentially on tumor cell lines. Methods: Four cell lines were used - two human breast cancer cell lines, one ER+ (MCF-7) and one ER- (MDA-MB-231); and two normal human mammary cell lines (HUVEC and MCF-10A). All cell lines were tested for viability assays, measurement of intra- and extracellular NO concentrations, cell death verification, and expression level of Pro-Caspase 3, PARP, cleaved PARP and Trx-1 proteins. Results: Differential toxicity of SNOKs to tumor lineages was demonstrated in cell viability assays and cell death assay. These results were correlated with higher intra and extracellular NO concentrations found in the tumor cell lines after incubation with the compounds. Differential toxicity was related to an xxiv apoptotic process due to a lower expression of Pro-Caspase 3 and Trx-1 proteins, and presence of cleavage of PARP protein. Conclusion: The studied compounds stimulate proliferation and/or maintain cell viability in the tumor cell lines when incubated at low concentrations, while inducing cell death at higher concentrations. These compounds presented molecular characteristics that make them as potential chemotherapeutic agents in the treatment of several types of cancer. Given the relevance of the results and potential chemotherapy to be explored further investigation of the mechanisms and pathways presented here would be of great clinical relevance in the future.
O câncer de mama feminino é o que mais acomete mulheres em todo mundo, e é classificado de acordo com a expressão do receptor de estrógeno (ER), sendo os tumores ER- mais agressivos e com pior prognóstico. O óxido nítrico (NO) é um radical livre gasoso produzido por organismos distribuídos por todos os filos, e com atuação em diversos sistemas do corpo humano. A sinalização celular mediada pelo NO ocorre a partir de modificações pós-tradução em proteínas, regendo tanto mecanismos fisiológicos quanto patológicos. A manipulação das concentrações endógenas de NO por meio da administração de doadores de NO seria um método interessante e viável de terapia, havendo um potencial terapêutico inexplorado nestas moléculas. Em condições fisiológicas as células permanecem em um ambiente redutor, e a manutenção da condição de equilíbrio redox nas células fica por conta dos sistemas antioxidantes, como o da proteína Tiorredoxina-1 (Trx-1), comprovadamente superexpressa em diversos tipos de tumor e associada com crescimento tumoral agressivo, resistência a terapias convencionais e taxas diminuídas de sobrevivência. Em trabalhos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa e por outros ficou evidenciado que a Trx-1 atua como mediadora da metabolização dos IS-nitrosotióis e na desnitrosilação de proteínas, sendo assim um ótimo alvo molecular de estudo tanto no entendimento da regulação destes processos quanto como no desenvolvimento de novos compostos que visem alterar a disponibilidade desta proteína e de oxidantes que possam alterar o ambiente celular. Objetivos: Este estudo teve como objetivo geral testar a susceptibilidade de linhagens celulares a diferentes concentrações dos derivados clorados nas posições orto- e meta- dos compostos S-nitrosot-aril-butanamidas (orto e metacloro SNOKs), buscando caracterizá-los como compostos com atividade antitumoral que exerceriam sua ação citotóxica preferencialmente sobre as células tumorais. Também investigamos os níveis de expressão da proteína antioxidante Trx-1 nas linhagens que foram expostas aos compostos com o objetivo de avaliarmos a importância dos mesmos na ação citotóxica preferencial observada. xxii Métodos: Foram utilizadas duas linhagens de adenocarcinoma mamário humano: uma ER+ (MCF-7) e uma ER- (MDA-MB-231); e duas das linhagens humanas não tumorais (HUVEC e MCF-10A). Para todas as linhagens celulares foram realizados os ensaios de viabilidade celular, mensuração das concentrações intra e extracelulares de NO, verificação de morte celular, e quantificação da expressão das proteínas Pró-Caspase 3, PARP, PARP clivada e Trx-1. Resultados: Foi evidenciada uma toxicidade diferencial dos SNOKs em relação às linhagens tumorais nos ensaios de viabilidade celular e verificação de morte celular. Estes resultados foram correlacionados com as altas concentrações de NO intra e extracelulares encontrados nas linhagens tumorais após incubação com os compostos. A toxicidade diferencial foi relacionada a um processo de apoptose após verificação de queda na expressão das proteínas Pró-Caspase 3 e Trx-1, e clivagem da proteína PARP. Conclusão: Este estudo demonstrou que a incubação das linhagens de adenocarcinoma mamário humano com os derivados clorados dos compostos S-nitroso-aril-butanamidas em baixas concentrações estimulam a proliferação e/ou mantêm a viabilidade celular, enquanto que induzem a morte celular em altas concentrações. Os doadores aqui estudados apresentaram características moleculares que os credenciam como potenciais agentes quimioterápicos no tratamento de tumores de mama. Dada a relevância dos resultados e o potencial quimioterápico dos compostos, uma investigação mais aprofundada dos mecanismos e vias aqui apresentados seria de grande relevância clínica no futuro.
O câncer de mama feminino é o que mais acomete mulheres em todo mundo, e é classificado de acordo com a expressão do receptor de estrógeno (ER), sendo os tumores ER- mais agressivos e com pior prognóstico. O óxido nítrico (NO) é um radical livre gasoso produzido por organismos distribuídos por todos os filos, e com atuação em diversos sistemas do corpo humano. A sinalização celular mediada pelo NO ocorre a partir de modificações pós-tradução em proteínas, regendo tanto mecanismos fisiológicos quanto patológicos. A manipulação das concentrações endógenas de NO por meio da administração de doadores de NO seria um método interessante e viável de terapia, havendo um potencial terapêutico inexplorado nestas moléculas. Em condições fisiológicas as células permanecem em um ambiente redutor, e a manutenção da condição de equilíbrio redox nas células fica por conta dos sistemas antioxidantes, como o da proteína Tiorredoxina-1 (Trx-1), comprovadamente superexpressa em diversos tipos de tumor e associada com crescimento tumoral agressivo, resistência a terapias convencionais e taxas diminuídas de sobrevivência. Em trabalhos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa e por outros ficou evidenciado que a Trx-1 atua como mediadora da metabolização dos IS-nitrosotióis e na desnitrosilação de proteínas, sendo assim um ótimo alvo molecular de estudo tanto no entendimento da regulação destes processos quanto como no desenvolvimento de novos compostos que visem alterar a disponibilidade desta proteína e de oxidantes que possam alterar o ambiente celular. Objetivos: Este estudo teve como objetivo geral testar a susceptibilidade de linhagens celulares a diferentes concentrações dos derivados clorados nas posições orto- e meta- dos compostos S-nitrosot-aril-butanamidas (orto e metacloro SNOKs), buscando caracterizá-los como compostos com atividade antitumoral que exerceriam sua ação citotóxica preferencialmente sobre as células tumorais. Também investigamos os níveis de expressão da proteína antioxidante Trx-1 nas linhagens que foram expostas aos compostos com o objetivo de avaliarmos a importância dos mesmos na ação citotóxica preferencial observada. xxii Métodos: Foram utilizadas duas linhagens de adenocarcinoma mamário humano: uma ER+ (MCF-7) e uma ER- (MDA-MB-231); e duas das linhagens humanas não tumorais (HUVEC e MCF-10A). Para todas as linhagens celulares foram realizados os ensaios de viabilidade celular, mensuração das concentrações intra e extracelulares de NO, verificação de morte celular, e quantificação da expressão das proteínas Pró-Caspase 3, PARP, PARP clivada e Trx-1. Resultados: Foi evidenciada uma toxicidade diferencial dos SNOKs em relação às linhagens tumorais nos ensaios de viabilidade celular e verificação de morte celular. Estes resultados foram correlacionados com as altas concentrações de NO intra e extracelulares encontrados nas linhagens tumorais após incubação com os compostos. A toxicidade diferencial foi relacionada a um processo de apoptose após verificação de queda na expressão das proteínas Pró-Caspase 3 e Trx-1, e clivagem da proteína PARP. Conclusão: Este estudo demonstrou que a incubação das linhagens de adenocarcinoma mamário humano com os derivados clorados dos compostos S-nitroso-aril-butanamidas em baixas concentrações estimulam a proliferação e/ou mantêm a viabilidade celular, enquanto que induzem a morte celular em altas concentrações. Os doadores aqui estudados apresentaram características moleculares que os credenciam como potenciais agentes quimioterápicos no tratamento de tumores de mama. Dada a relevância dos resultados e o potencial quimioterápico dos compostos, uma investigação mais aprofundada dos mecanismos e vias aqui apresentados seria de grande relevância clínica no futuro.