Síntese, estudos conformacionais e de interação de fragmentos do receptor AT1 com análogos da angiotensina II contendo marcador de SPIN TOAC
Data
2006-05-30
Autores
Lopes, Douglas Duarte 
Orientadores
Nakaie, Clovis Ryuich
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Esta tese procurou desenvolver um projeto cujo objetivo principal foi o de testar uma estratégia inovadora de monitoramento espectroscópico de interação agonistafragmento de um receptor transmembranar. Neste caso, as opções de investigação destas interações entre peptídeos pequenos e no geral, muito solúveis são difíceis mas, seriam de grande relevância, no caso de poderse verificar com qual região (ou regiões) de um receptor, o seu agonista apresenta maior tendência de interação. Este tipo de informação seria certamente de enorme valia para o auxílio na elucidação do mecanismo de ligação do agonista e do funcionamento de um determinado receptor. Com base nestas considerações, desenvolveu nesta tese, uma estratégia de investigação da interação do peptídeo vasoativo angiotensina II (AII), através de um análogo paramagnético, com o seu receptor AT1. Levandose em conta, hipóteses já existentes na literatura que destacam um sítio de interação do agonista com um segmento híbrido ligando as regiões Nterminal (1827 ou P15) e a terceira alça externa (266278 ou P13) do AT1, alguns fragmentos ligando estas duas regiões foram inicialmente sintetizados. Aproveitando esta fase inicital, procurouse investigar também problemas de dificuldades de síntese pois, em alguns análogos, havia a necessidade de formação de pontes dissulfeto entre segmentos distintos ou mesmo pelo fato de alguns, serem longos e bastante hidrofóbicos (6697, TM32), o que normalmente reduz bastante o rendimento da síntese. Em termos dos principais resultados obtidos, podese destacar:
a) A análise da síntese no caso da seqüência transmembranar TM 32 (e de seu fragmento menor TM 16) por serem longas e fortemente hidrofóbicas mostrou clara dificuldade na parte sintética, principalmente à medida que ocorre o crescimento peptídico. O rendimento final foi de cerca de 25% ao final da síntese do TM 32, analisandose os perfis de HPLC do material bruto clivado da resina. O tempo de retenção de cada fragmento (crescimento de 8 em 8 resíduos) destacou uma clara correlação linear entre o tempo de retenção em HPLC e a hidrofobicidade de cada fragmento, concordante portanto com o aumento também linear da hidrofobidade de cada segmento em função do seu tamanho. Estudos de solvatação destas peptidilresinas, tanto por medidas do tamanho dos grãos solvatados quanto da mobilidade das cadeias peptídicas e da matriz polimérica obtida por RPE de peptidilresinas do TM32 marcadas com TOAC, indicaram que DCM e DMF foram os melhores solventes no começo da síntese mas, os piores ao final, quando a vantagem passou a ser do NMP e DMSO, devido ao aumento da hidrofobicidade da matriz polimérica.
b) No caso dos demais fragmentos do receptor AT1, envolvendo os segmentos P15 e P13, notaramse as esperadas dificuldades na fase de acoplamento de aminoácidos, principalmente em tamanhos que abrangem de 5 a 15 aminoácidos, conforme já relatado na literatura. De qualquer modo, a parte mais crucial da síntese destes peptídeos foi o da formação da ponte dissulfeto entre os resíduos de Cys presentes em cada um dos fragmentos acima mencionados. Os peptídeos contendo o espaçador C11 ou GGC11GG não foram obtidos pela inviabilidade da formação da ponte SS, indicando a forte dependência desta reação às conformações dos mesmos que podem facilitar ou não a aproximação necessária dos grupos sulfidrilas para a reação de oxidação.
c) Em termos conformacionais obtidos por CD, os fragmentos do AT1 apresentaram no geral, estruturas estendidas ou pouco estruturadas em pH neutro mas, com perfis em muitos casos, diferenciados entre si. Em raros compostos e situações, notouse a indução de conformação do tipo hélice como foi observado no caso dos peptídeos P15P13c e P15C6P13 quando em alta concentração de TFE ou em pH alcalino, no caso do primeiro análogo. Além do mais, destaquese a alta flexibilidade do composto P15(C11)2P13 (tanto na variação de pH quanto na quantidade de TFE), possivelmente devido à elevada dinâmica de uma estrutura que contem mais de duas dezenas de grupamentos alifáticos do tipo –CH2no meio de sua seqüência.
d) O tópico mais relevante e final do presente estudo envolveu o monitoramento da possível interação do análogo ativo da AII (TOAC1AII) com todos os fragmentos obtidos do AT1, via espectros de RPE. Dos oito segmentos do receptor testados, P15C6P13 e P15(C11)2P13 foram os que interagiram com este agonista, vindo a seguir e em menor intensidade, o fragmento P15P13c. Houve um incremento da imobilização de cerca de 3 vezes do TOAC1AII. no caso da interação com os dois primeiros análogos, indicando significativa associação entre estes fragmentos do receptor com o agonista ativo TOAC1AII. E reforçando estes indícios de formação deste complexo intermolecular, observouse também uma clara diminuição dos valores de desdobramento hiperfino isotrópico (aN), o que indica a passagem do radical nitróxido do TOAC para um ambiente mais apolar, devido talvez ao tipo de complexo formado com os fragmentos do receptor. Em suma, esta estratégia inovadora de, por RPE e emprego de agonista contendo um marcador de spin do tipo aminoácido (TOAC), se mostrou eficiente na detecção de uma interação entre o agonista e uma região do receptor do mesmo. Estes dados iniciais deixam em aberto portanto, uma estratégia espectroscópica diferenciada e que pode ser bastante útil no estudo de qualquer interação agonistareceptor. Apenas como informação adicional, o análogo inativo da AII (TOAC4AII), utilizado como espécie de controle, não apresentou interação com os segmentos do AT1 acima mencionados, com exceção do fragmento transmembranar TM 32. Como o derivado TOAC4AII é inativo, admitese que esta ligação apenas com o segmento transmembranar TM 32 do AT1 é inespecífica, não havendo correlação com a hipótese mais amplamente aceita de ligação agonistaAT1 envolvendo de algum modo, os segmentos P15 e P13. E em termos de encontrar alguma correlação entre conformação dos segmentos do receptor e o grau de interação com o análogo do agonista, podese apenas destacar que os peptídeos que mostraram maior tendência a adquirir uma conformação mais estruturada, do tipo hélice em TFE, foram exatamente os dois que apresentaram tendência de interação com o TOAC1AII.
Descrição
Citação
LOPES, Claudio Duarte. Síntese, estudos conformacionais e de interação de fragmentos do receptor at1 com análogos da angiotensina II contendo marcador de SPIN TOAC. 2007. 151 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2007.