Caracterização da TCCYP19 e o estudo do seu papel durante a infecção celular causada pelo Trypanosoma cruzi
Data
2020-12-18
Autores
Santos, Gregory Pedroso Dos 
Orientadores
Schenkman, Sergio
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Chagas disease caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi is characterized by an extensive inflammatory process in the organs and sites most affected by the infection. To understand the evasion mechanisms developed by the parasite in response to attempts to control the infection by the host organism - several studies have being published describing an intriguing relationship between reactive oxygen species (ROS) produced by infected cells, and their ability to induce or increase in the proliferation of T. cruzi. So far, the mechanisms involved in these processes are still unknown. However, these studies suggested that parasites have developed a mechanism to deal with oxidative stress, which nullifies the antimicrobial capacity, or which is capable of converting these oxidative environments to their benefit. In this thesis, we studied a chaperone of 19 kDa, expressed by T. cruzi, entitled cyclophilin 19 (TcCyp19), that has high similarity to cyclophilin A (CypA), expressed by mammals. CypA acts in the activation of the cellular immune and inflammatory response, as well as in the translocation of the p47phox subunit - responsible for activation of the NADPH oxidase enzyme complex, which leads to the production reactive oxygen species. We found that TcCyp19 is expressed in all T. cruzi stages, being more abundant in the epimastigote form of the parasite. Through adaptations carried out by genetic engineering, we have generated parasites capable of expressing TcCyp19 fused to a HA tag. This approach allowed us to detect its secretion by the intracellular amastigote form in the cytosol of the host cell . Furthermore, we observed that modulations in the expression of TcCyp19, both in the parasite and through the expression carried out directly in the host cell, increased the intracellular multiplication capacity of the parasite concomitant with TcCyp19 release in the cytosol of infected cells. We also noticed a parallel increase in the production of ROS, during infections and when rat myoblast L6 cells expressed TcCyp19. In contrast, parasites depleted of TcCyp19 gene showed a substantial reduction in the intracellular amastigotes proliferation, similar to what was observed for wild type parasites treated with antioxidant enzymes or with a cyclosporine A (a specific inhibitor of cyclophilins). The knockout parasites also generated a significant reduction in the production of ROS in infected cells. Both reduced proliferation and low ROS production were reestablished by the add-back parasites or when infecting L6 cells that express the TcCyp19. Mechanistically, the production of ROS generated by TcCyp19 appears to be related to the activation of the NADPH oxidase by the translocation of the p47phox subunit to the cell surface as previously found for CypA. In fact, part of the TcCyp19 colocalize of stretches of p47phox aligned with microfilaments in L6 cells and concentrate in the leading edges of the cells in regions proposed to contain active NADPH oxidase. We conclude that TcCyp19 is a key molecule responsible for inducing increased production of ROS, which in turn can influence proliferation of parasites and guarantee the prevalence of infection.
A doença de Chagas causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi é caracterizada por um extenso processo inflamatório nos órgãos e sítios mais acometidos pela infecção. Para compreender os mecanismos de evasão desenvolvidos pelo parasita em resposta às tentativas de controle da infecção pelo organismo hospedeiro - vários trabalhos vêm descrevendo a intrigante relação entre as espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas pelas células infectadas, e sua capacidade de induzir o aumento na proliferação do T. cruzi. Até o momento ainda são elusivos os mecanismos envolvidos nestes processos. Contudo, os estudos desenvolvidos sugerem que os parasitas desenvolveram mecanismos de resposta ao estresse oxidativo, que anulam a capacidade antimicrobiana destas reações ou que sejam capazes de converter estes ambientes oxidativos em seu próprio benefício. Nesta tese, foi estudado o papel da chaperona de 19 kDa expressa pelo T. cruzi, intitulada ciclofilina 19 (TcCyp19), que possui considerável conservação estrutural com a ciclofilina A (CypA) de mamíferos. A CypA promove alterações conformacionais de proteínas pela isomerização de ligações peptídicas com o aminoácido prolina, resultando em diversas respostas celulares. Entre elas está a translocação da subunidade p47phox do citosol para a membrana e formação do complexo enzimático NADPH oxidase ativo, que gera espécies reativas de oxigênio. Verificamos que a TcCyp19 possui considerável expressão em todas as formas celulares do T. cruzi. Desenvolvemos parasitas capazes de expressar a TcCyp19 fusionada ao epítopo HA do vírus da hemaglutinina, o que permitiu detectar a sua liberação no citosol de células infectadas pelo T. cruzi. A maior expressão da TcCyp19, tanto no parasita, como na célula hospedeira, levou a um aumento na multiplicação dos parasitas durante a infecção – principalmente após o período de 48 horas, momento este, quando ocorre aumento expressivo de sua secreção no citosol das células infectadas. Em paralelo, verificamos que a expressão da TcCyp19 na célula hospedeira ou durante a infecção, promoveu um aumento de espécies reativas de oxigênio. A proliferação e a geração de espécies reativas de oxigênio foram reduzidas em parasitas nocaute para a expressão do gene da TcCyp19 - obitida através da técnica de edição genética CRISPR Cas9, de maneira similar ao observado nas infecções por parasitas selvagens tratadas com enzimas antioxidantes ou com a ciclosporina A (um inibidor específico de ciclofilinas). Tanto a reduzida proliferação, como a baixa produção de espécies reativas de oxigênio foram readquiridas pelos parasitas no qual a expressão da TcCyp19 foi reestabelecida. O mesmo foi observado nas infecções desenvolvidas pelos parasitas nocaute nas células expressando a TcCyp19. Da mesma forma que a CypA, a TcCyp19 se concentra nas bordas das células e se notou por microscopia de super-resolução a formação de trilhas de marcação da TcCyp19, p47phox e filamentos de actina. Como conclusão , propomos uma nova funcionalidade para a TcCyp19 durante a infecção causada pelo T. cruzi, indicando assim, que sua presença no citosol das células infectadas pode mimetizar a atividade de chaperona da CypA, induzindo maior produção de ERO - que por sua vez é capaz de influenciar maior proliferação do parasita e assegurar a prevalência da infecção.
A doença de Chagas causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi é caracterizada por um extenso processo inflamatório nos órgãos e sítios mais acometidos pela infecção. Para compreender os mecanismos de evasão desenvolvidos pelo parasita em resposta às tentativas de controle da infecção pelo organismo hospedeiro - vários trabalhos vêm descrevendo a intrigante relação entre as espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas pelas células infectadas, e sua capacidade de induzir o aumento na proliferação do T. cruzi. Até o momento ainda são elusivos os mecanismos envolvidos nestes processos. Contudo, os estudos desenvolvidos sugerem que os parasitas desenvolveram mecanismos de resposta ao estresse oxidativo, que anulam a capacidade antimicrobiana destas reações ou que sejam capazes de converter estes ambientes oxidativos em seu próprio benefício. Nesta tese, foi estudado o papel da chaperona de 19 kDa expressa pelo T. cruzi, intitulada ciclofilina 19 (TcCyp19), que possui considerável conservação estrutural com a ciclofilina A (CypA) de mamíferos. A CypA promove alterações conformacionais de proteínas pela isomerização de ligações peptídicas com o aminoácido prolina, resultando em diversas respostas celulares. Entre elas está a translocação da subunidade p47phox do citosol para a membrana e formação do complexo enzimático NADPH oxidase ativo, que gera espécies reativas de oxigênio. Verificamos que a TcCyp19 possui considerável expressão em todas as formas celulares do T. cruzi. Desenvolvemos parasitas capazes de expressar a TcCyp19 fusionada ao epítopo HA do vírus da hemaglutinina, o que permitiu detectar a sua liberação no citosol de células infectadas pelo T. cruzi. A maior expressão da TcCyp19, tanto no parasita, como na célula hospedeira, levou a um aumento na multiplicação dos parasitas durante a infecção – principalmente após o período de 48 horas, momento este, quando ocorre aumento expressivo de sua secreção no citosol das células infectadas. Em paralelo, verificamos que a expressão da TcCyp19 na célula hospedeira ou durante a infecção, promoveu um aumento de espécies reativas de oxigênio. A proliferação e a geração de espécies reativas de oxigênio foram reduzidas em parasitas nocaute para a expressão do gene da TcCyp19 - obitida através da técnica de edição genética CRISPR Cas9, de maneira similar ao observado nas infecções por parasitas selvagens tratadas com enzimas antioxidantes ou com a ciclosporina A (um inibidor específico de ciclofilinas). Tanto a reduzida proliferação, como a baixa produção de espécies reativas de oxigênio foram readquiridas pelos parasitas no qual a expressão da TcCyp19 foi reestabelecida. O mesmo foi observado nas infecções desenvolvidas pelos parasitas nocaute nas células expressando a TcCyp19. Da mesma forma que a CypA, a TcCyp19 se concentra nas bordas das células e se notou por microscopia de super-resolução a formação de trilhas de marcação da TcCyp19, p47phox e filamentos de actina. Como conclusão , propomos uma nova funcionalidade para a TcCyp19 durante a infecção causada pelo T. cruzi, indicando assim, que sua presença no citosol das células infectadas pode mimetizar a atividade de chaperona da CypA, induzindo maior produção de ERO - que por sua vez é capaz de influenciar maior proliferação do parasita e assegurar a prevalência da infecção.