Mecanismos envolvidos no atenuamento da inflamação pulmonar alérgica em ratos com baixo peso ao nascer
Data
2018-02-26
Autores
Ramos, Ana Paula Almeida 
Orientadores
Landgraf, Maristella de Almeida Vitta
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Food restriction during the gestational period leads to changes in the pattern of fetal
growth and development. In previous studies, our group demonstrated that intrauterine
malnutrition caused elevated levels of basal corticosterone and reduced allergic lung
inflammatory response in Wistar rats. Based on these findings, the present study
aimed to evaluate mechanisms involved in the attenuation of the allergic pulmonary
inflammatory response, such as the role of corticosterone and epigenetic alterations.
Male Wistar rats, with low birth weight (LBW), from malnourished females during the
whole gestational period, with 9 weeks of age were sensitized and challenged with
ovalbumin. Allergic pulmonary response was studied in these animals at 12 weeks of
age. The characterization of the inflammatory response was analyzed by analysis of
the cellular infiltrate in the bronchoalveolar lavage and histological section of the
peribronchial region, where we verified a lower cellular infiltrate in the LBW lungs. The
quantification of IgE, cytokines, ACTH and CORT was performed by multiplex assay
and quantification of CBG, PGE2 and DNMT1 by Kit EIA. Gene expression of 11βHSD1, 11β-HSD2, COX-1, COX-2, GR and RUNX3 was evaluated by RT-PCR Real
Time, while the protein expression of COX-1, COX-2 and GR was evaluated by
Western blotting. Global DNA methylation quantified by Methylamp global DNA
methylation. LBW rats sensitized and challenged with ovalbumin (OVA/OVA)
demonstrated lower serum IgE levels than normal birth weight (NBW) rats OVA/OVA.
It was observed an imbalance in cytokines production, in LBW rats: elevated basal
levels of IL-4 and IL-10 with consequent failure to increase these cytokines after
stimulation with OVA; failure to raise levels of IL-5 and IL-6 and lower IL-13 levels after
OVA challenge, in addition to higher levels of IL-1β, TNF-α and IFN-γ. PGE2 levels
were lower in LBW OVA/OVA rats than NBW OVA/OVA rats. LBW OVA/OVA rats
failed to increase the gene and protein expression of the COX-1 and COX-2 enzymes.
LBW rats presented high basal levels of CORT and failed to increase these levels after
challenge with OVA, different from that observed in NBW OVA/OVA rats. On the other
hand, the challenge with OVA did not modify ACTH levels in LBW rats, whereas in
NBW OVA/OVA rats it caused reduction. After stimulation with OVA, only NBW rats
demonstrated a reduction in GR expression; the expression of 11β-HSD2 did not differ
when compared LBW vs. NBW groups, and the LBW OVA/OVA vs. NBW OVA/OVA
groups, but LBW group failed to increase 11β-HSD2 expression after OVA
stimulation.There was no difference in CBG levels among different groups. Global
methylation levels as well as DNMT1 enzyme levels were significantly higher in LBW
OVA/PBS rats compared to NBW OVA/PBS; only LBW OVA/OVA rats decreased the
concentration of DNMT1. The RUNX3 gene expression did not differ when compared
LBW vs. NBW groups and the LBW OVA/OVA vs. NBW OVA/OVA groups.
Considering these results, we propose that the failure in corticosterone regulation and
the imbalance in the production of inflammatory mediators, together with DNA
hypermethylation in lung tissue could be involved in the attenuation of the allergic
inflammatory response presented by LBW rats.
A restrição alimentar durante todo o período gestacional acarreta em modificações no padrão de crescimento e desenvolvimento fetal. Em trabalhos anteriores, nosso grupo demonstrou que a restrição alimentar intrauterina acarretou, em ratos Wistar, níveis elevados de corticosterona basal e atenuamento da resposta inflamatória pulmonar alérgica. Com base nesses achados, o presente estudo teve como objetivo avaliar mecanismos envolvidos no atenuamento da resposta inflamatória pulmonar alérgica, como o papel da corticosterona e alterações epigenéticas. Ratos Wistar machos, com baixo peso ao nascer (BPN), provenientes de fêmeas desnutridas durante todo o período gestacional, com 9 semanas de idade foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. A resposta pulmonar alérgica foi estudada nesses animais com 12 semanas de idade. A caracterização da resposta inflamatória foi realizada por análise do infiltrado celular no lavado broncoalveolar e em corte histológico da região peribronquial, onde verificamos menor infiltrado celular no pulmão de ratos BPN. A quantificação da IgE, citocinas, ACTH e CORT foi realizado por ensaio multiplex e a dosagem da CBG, PGE2 e DNMT1 por kit EIA. A expressão gênica da 11β-HSD1, 11β-HSD2, COX-1, COX-2, GR e RUNX3 foi avaliado por RT-PCR em Tempo Real, enquanto que a expressão proteica da COX-1, COX-2 e do GR foi avaliado por Western Blotting. A metilação global do DNA foi quantificado pelo “Methylamp global DNA methylation”. Ratos BPN sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA/OVA) apresentaram níveis menores de IgE no soro do que ratos com peso normal ao nascer (PNN) OVA/OVA. Foi observado desbalanço na produção de citocinas, em ratos BPN: níveis basais elevados de IL-4 e IL-10, com falha no aumento dessas citocinas após o estímulo com OVA; falha em elevar os níveis da IL-5 e IL-6 e níveis menores de IL-13, após estímulo com OVA; além disso, ratos BPN apresentaram níveis mais elevados de IL-1, TNF- e IFN-y após o estímulo com OVA do que ratos PNN. Os níveis da PGE2 foram menores em ratos BPN OVA/OVA quando comparado aos ratos PNN OVA/OVA. Além disso, ratos BPN OVA/OVA falharam em aumentar a expressão gênica e proteica das enzimas COX-1 e COX-2. Ratos BPN OVA/PBS apresentaram níveis basais elevados de CORT e falharam em aumentar esses níveis após desafio com OVA, diferente do que foi observado em ratos PNN OVA/OVA. Por outro lado, o desafio com OVA não modificou os níveis de ACTH em ratos BPN, enquanto que nos ratos PNN OVA/OVA causou redução. Após o estímulo com OVA, apenas os ratos PNN demostraram redução na expressão do GR; a expressão de 11β-HSD2 não diferiu quando comparado os grupos BPN vs PNN e os grupos BPN OVA/OVA vs PNN OVA/OVA, mas BPN falharam em aumentar a expressão dessa enzima após estímulo com OVA. Não foi observada diferença nos níveis de CBG entre os diferentes grupos. Os níveis de metilação global, bem como da enzima DNMT1 foram significativamente maiores em ratos BPN OVA/PBS comparados aos PNN OVA/PBS, sendo que, apenas os ratos BPN diminuíram a concentração da DNMT1 após estímulo com OVA. A expressão gênica da RUNX3 não diferiu quando comparado os grupos BPN vs PNN e os grupos BPN OVA/OVA vs PNN OVA/OVA. Considerando esses resultados, propomos que alterações na regulação de corticosterona e o desequilíbrio na produção de mediadores inflamatórios, juntamente com hipermetilação do DNA pulmonar podem estar envolvidos no atenuamento da resposta inflamatória alérgica presente em ratos BPN.
A restrição alimentar durante todo o período gestacional acarreta em modificações no padrão de crescimento e desenvolvimento fetal. Em trabalhos anteriores, nosso grupo demonstrou que a restrição alimentar intrauterina acarretou, em ratos Wistar, níveis elevados de corticosterona basal e atenuamento da resposta inflamatória pulmonar alérgica. Com base nesses achados, o presente estudo teve como objetivo avaliar mecanismos envolvidos no atenuamento da resposta inflamatória pulmonar alérgica, como o papel da corticosterona e alterações epigenéticas. Ratos Wistar machos, com baixo peso ao nascer (BPN), provenientes de fêmeas desnutridas durante todo o período gestacional, com 9 semanas de idade foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. A resposta pulmonar alérgica foi estudada nesses animais com 12 semanas de idade. A caracterização da resposta inflamatória foi realizada por análise do infiltrado celular no lavado broncoalveolar e em corte histológico da região peribronquial, onde verificamos menor infiltrado celular no pulmão de ratos BPN. A quantificação da IgE, citocinas, ACTH e CORT foi realizado por ensaio multiplex e a dosagem da CBG, PGE2 e DNMT1 por kit EIA. A expressão gênica da 11β-HSD1, 11β-HSD2, COX-1, COX-2, GR e RUNX3 foi avaliado por RT-PCR em Tempo Real, enquanto que a expressão proteica da COX-1, COX-2 e do GR foi avaliado por Western Blotting. A metilação global do DNA foi quantificado pelo “Methylamp global DNA methylation”. Ratos BPN sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA/OVA) apresentaram níveis menores de IgE no soro do que ratos com peso normal ao nascer (PNN) OVA/OVA. Foi observado desbalanço na produção de citocinas, em ratos BPN: níveis basais elevados de IL-4 e IL-10, com falha no aumento dessas citocinas após o estímulo com OVA; falha em elevar os níveis da IL-5 e IL-6 e níveis menores de IL-13, após estímulo com OVA; além disso, ratos BPN apresentaram níveis mais elevados de IL-1, TNF- e IFN-y após o estímulo com OVA do que ratos PNN. Os níveis da PGE2 foram menores em ratos BPN OVA/OVA quando comparado aos ratos PNN OVA/OVA. Além disso, ratos BPN OVA/OVA falharam em aumentar a expressão gênica e proteica das enzimas COX-1 e COX-2. Ratos BPN OVA/PBS apresentaram níveis basais elevados de CORT e falharam em aumentar esses níveis após desafio com OVA, diferente do que foi observado em ratos PNN OVA/OVA. Por outro lado, o desafio com OVA não modificou os níveis de ACTH em ratos BPN, enquanto que nos ratos PNN OVA/OVA causou redução. Após o estímulo com OVA, apenas os ratos PNN demostraram redução na expressão do GR; a expressão de 11β-HSD2 não diferiu quando comparado os grupos BPN vs PNN e os grupos BPN OVA/OVA vs PNN OVA/OVA, mas BPN falharam em aumentar a expressão dessa enzima após estímulo com OVA. Não foi observada diferença nos níveis de CBG entre os diferentes grupos. Os níveis de metilação global, bem como da enzima DNMT1 foram significativamente maiores em ratos BPN OVA/PBS comparados aos PNN OVA/PBS, sendo que, apenas os ratos BPN diminuíram a concentração da DNMT1 após estímulo com OVA. A expressão gênica da RUNX3 não diferiu quando comparado os grupos BPN vs PNN e os grupos BPN OVA/OVA vs PNN OVA/OVA. Considerando esses resultados, propomos que alterações na regulação de corticosterona e o desequilíbrio na produção de mediadores inflamatórios, juntamente com hipermetilação do DNA pulmonar podem estar envolvidos no atenuamento da resposta inflamatória alérgica presente em ratos BPN.