Investigação do perfil metabólico e mecanismo molecular associado a expressão de PVALB nos tumores de células de Hürthle e avaliação do efeito do Mebendazol no tratamento dos carcinomas da tiroide
Data
2021-05-19
Orientadores
Cerutti, Janete Maria 
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
O carcinoma papilífero da tiroide (CPT) é a neoplasia mais comum dentro de todos os carcinomas da tiroide, respondendo, na maioria dos casos, à terapia e apresentando um prognóstico favorável. No entanto, um subconjunto de CPT pode se desdiferenciar e progredir para o carcinoma anaplásico da tiroide (CAT), sendo este o subtipo mais agressivo, altamente invasivo e com sobrevida de 6 meses após o diagnóstico. Os CAT não respondem ao tratamento convencional com o radioiodo, existindo assim uma necessidade de desenvolver um tratamento mais eficaz e seguro para os pacientes com câncer de tiroide com alto risco de progressão e metástases. Assim o visamos avaliar o potencial antitumoral do mebendazol (MBZ) nas linhagens celulares de Carcinoma Carcinoma Papilífero da Tiroide (B-CPAP) e Anaplásico da tiroide (8505c). Avaliou-se os efeitos do tratamento do MBZ in vitro na proliferação, ciclo celular, morte celular via apoptose, migração e invasão celulares, bem como modulação das vias de sinalização por western blot. No estudo in vivo, realizou-se modelo ortotópico da tiroide. Deste último, avaliou-se a presença de metástase pulmonar, bem como a expressão de CD31 e Ki67 por imunohistoquímica. MBZ foi capaz de diminuir a proliferação celular ativando a morte celular via apoptose, pela ativação da caspase-3, bem como uma para no ciclo celular na fase G2/M. Na linhagem 8505c, MBZ inibiu a migração e invasão celular, bem como, inibiu a fosforilação de AKT e STAT3. No modelo in vivo, MBZ foi capaz de regredir 100% o tumor ortotópico (B-CPAP) e uma parada no crescumento tumoral na linhagem de carcinoma anaplásico (8605c). Os tumores apresentaram uma diminuição na expressão de marcadores de proliferação (Ki67) e de vascularização (CD31+). Os dados mostram que MBZ pode se tornar um importante agente terapêutico para o tratamento do carcinoma papilíifero e anaplásico da tiroide, apresentando baixa toxicidade e levando à regressão do tumor bem como a morte celular.
A partir da análise realizada pela técnica de SAGE (Serial Analysisof Gene Expression) realizada em amostras benignas e malignas da tiroide com posterior validação por PCR em tempo real e imunohistoquímica verificamos que a expressão combinada de cinco marcadores (PVALB, ITM1 e C10rf24, ARG2 e DDIT3), é capaz de distinguir as lesões benignas e malignas da tiroide com alta sensibilidade e especificidade. Entre estes, PVALB (Parvalbumin) é especificamente expresso nos adenomas de células de Hürthle, desta forma, é um marcador de benignidade. O gene PVALB codifica uma proteína quelante de cálcio (Ca2+) e para compreender o seu papel na patogênese dos tumores da tiroide, nosso grupo realizou estudos in vitro. Demonstramos, por meio da expressão ectópica de PVALB em linhagens celulares de carcinoma folicular da tiroide uso de indicadores específicos de Ca2+ livre Fluo-4, AM (citoplasma) e Rhod-2, AM (mitocôndria) e tratamento com tapsigargina, um inibidor seletivo da Ca2+-ATPase do retículo (SERCA), que PVALB reduz as taxas de Ca2+ livre no citoplasma e na mitochondria. Além disso, verificamos que PVALB reduziu as taxas de proliferação celular e induziu a morte celular, provavelmente via diminuição da fosforilação de GSK-3β e AKT e expressão de proteínas associadas ao estresse de retículo (PERK). Além disso, por meio da análise das células por Microscopia Eletrônica de Transmissão, observamos que as células que expressam PVALB apresentam uma alteração na morfologia celular. PVALB promoveu um aumento no tamanho celular e aumento no número das mitocôndrias. Por fim, observamos que a expressão de PVALB está correlacionada com a presença de cálcio nas amostras de ACH (Adenoma de Células de Hürthle), confirmando nossos resultados obtidos in vitro. Estes dados em conjunto, sugerem um importante papel de PVALB na aquisição das características fenotípicas comumente observadas nas células de Hürthle e que PVALB pode atuar como um gene supressor tumoral. Neste projeto propomos analisar o perfil metabólico associado à expressão ectópica de PVALB nas linhagens celulares de carcinomas folicular da tiroide 22 e, desta forma, identificar possíveis as vias metabólicas que possam contribuir na patogênese dos tumores da tiroide. Os ensaios in vitro mostram que PVALB promoveu alterações nos metabólitos do ciclo TCA, com aumento principalmente do succinato nos ACH em comparação aos CCH. Apresentou uma menor taxa de consumo de oxigênio, síntese de ATP e alteração nos níveis de ROS. Demonstramos, também, que PVALB diminui as taxas de autofagia. Assim, nossos dados suportam a hipótese que PVALB tem um importante papel na progressão dos tumores de células de Hürthle pela modulação de cálcio citoplasmático e mitocondrial e consequentemente alteração na concentração dos metabólitos do ciclo TCA.
A partir da análise realizada pela técnica de SAGE (Serial Analysisof Gene Expression) realizada em amostras benignas e malignas da tiroide com posterior validação por PCR em tempo real e imunohistoquímica verificamos que a expressão combinada de cinco marcadores (PVALB, ITM1 e C10rf24, ARG2 e DDIT3), é capaz de distinguir as lesões benignas e malignas da tiroide com alta sensibilidade e especificidade. Entre estes, PVALB (Parvalbumin) é especificamente expresso nos adenomas de células de Hürthle, desta forma, é um marcador de benignidade. O gene PVALB codifica uma proteína quelante de cálcio (Ca2+) e para compreender o seu papel na patogênese dos tumores da tiroide, nosso grupo realizou estudos in vitro. Demonstramos, por meio da expressão ectópica de PVALB em linhagens celulares de carcinoma folicular da tiroide uso de indicadores específicos de Ca2+ livre Fluo-4, AM (citoplasma) e Rhod-2, AM (mitocôndria) e tratamento com tapsigargina, um inibidor seletivo da Ca2+-ATPase do retículo (SERCA), que PVALB reduz as taxas de Ca2+ livre no citoplasma e na mitochondria. Além disso, verificamos que PVALB reduziu as taxas de proliferação celular e induziu a morte celular, provavelmente via diminuição da fosforilação de GSK-3β e AKT e expressão de proteínas associadas ao estresse de retículo (PERK). Além disso, por meio da análise das células por Microscopia Eletrônica de Transmissão, observamos que as células que expressam PVALB apresentam uma alteração na morfologia celular. PVALB promoveu um aumento no tamanho celular e aumento no número das mitocôndrias. Por fim, observamos que a expressão de PVALB está correlacionada com a presença de cálcio nas amostras de ACH (Adenoma de Células de Hürthle), confirmando nossos resultados obtidos in vitro. Estes dados em conjunto, sugerem um importante papel de PVALB na aquisição das características fenotípicas comumente observadas nas células de Hürthle e que PVALB pode atuar como um gene supressor tumoral. Neste projeto propomos analisar o perfil metabólico associado à expressão ectópica de PVALB nas linhagens celulares de carcinomas folicular da tiroide 22 e, desta forma, identificar possíveis as vias metabólicas que possam contribuir na patogênese dos tumores da tiroide. Os ensaios in vitro mostram que PVALB promoveu alterações nos metabólitos do ciclo TCA, com aumento principalmente do succinato nos ACH em comparação aos CCH. Apresentou uma menor taxa de consumo de oxigênio, síntese de ATP e alteração nos níveis de ROS. Demonstramos, também, que PVALB diminui as taxas de autofagia. Assim, nossos dados suportam a hipótese que PVALB tem um importante papel na progressão dos tumores de células de Hürthle pela modulação de cálcio citoplasmático e mitocondrial e consequentemente alteração na concentração dos metabólitos do ciclo TCA.
Descrição
Citação
MENDES, Thais Biude. Investigação do perfil metabólico e mecanismo molecular associado a expressão de PVALB nos tumores de células de Hürthle e avaliação do efeito do Mebendazol no tratamento dos carcinomas da tiroide. São Paulo, 2021. 186 p. Tese (Doutorado em Biologia Estrutural e Funcional) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2021.