Caracterização do autocitrulinoma das células ECV304 e sua utilização como fonte de antígenos citrulinados in vitro para detecção de autoanticorpos na artrite reumatoide
| dc.contributor.advisor | Andrade, Luiz Eduardo Coelho [UNIFESP] | |
| dc.contributor.advisorLattes | http://lattes.cnpq.br/3012990107397690 | |
| dc.contributor.author | França, Natalia Regine de [UNIFESP] | |
| dc.contributor.authorLattes | http://lattes.cnpq.br/9606565258812948 | |
| dc.coverage.spatial | São Paulo | |
| dc.date.accessioned | 2024-12-16T17:17:16Z | |
| dc.date.available | 2024-12-16T17:17:16Z | |
| dc.date.issued | 2024-10-08 | |
| dc.description.abstract | Proteínas citrulinadas contêm epítopos citrulinados que são especificamente reconhecidos por anticorpos antiproteínas/peptídeos citrulinadas (ACPA), um dos principais sistemas de autoanticorpos na artrite reumatoide (AR). A inflamação pode promover citrulinação de diversas proteínas mediante um processo enzimático realizado pela enzima peptidilarginina deiminase (PAD) que leva à conversão do aminoácido arginina em citrulina. Os ACPA são biomarcadores importantes na AR com relevância na patogênese, diagnóstico e prognóstico da enfermidade. Nesse trabalho, investigamos a presença de enzimas PAD e exploramos a o potencial de citrulinação da linhagem celular ECV304 e sua possível utilização como substrato antigênico para imunoensaios para pesquisa de ACPA em pacientes com AR. Um teste de ELISA in-house foi desenvolvido com extrato de células ECV304 como substrato antigênico para detecção de ACPA, sendo validado com duas coortes de pacientes de AR e controles. Soros de pacientes com AR com altos títulos de ACPA foram utilizados para a análise do citrulinoma-ECV304. Objetivo: Caracterizar a linhagem celular ECV304 em relação a sua capacidade de citrulinação in vitro e descrever seu citrulinoma, para possível utilização do extrato celular citrulinado como substrato antigênico em imunoensaio para detecção de ACPA em pacientes sob suspeita de AR. Métodos: Citrulinação proteica foi verificada por Western blot em sete linhagens celulares humanas. A produção de citrulina foi quantificada por ensaio colorimétrico. As enzimas PAD, envolvidas no processo de citrulinação nas células ECV304, foram identificadas por PCR com primers específicos. Proteínas citrulinadas reconhecidas pelo soro de pacientes com AR, foram imunoprecipitadas e identificadas por espectrometria de massas para caracterização do citrulinoma. Um sistema de ELISA in-house utilizando extrato de células ECV304 (citrulinado e controle) foi testado utilizando soro de pacientes com AR (n=177), soro de pacientes com outras doenças reumáticas (não-AR) (n=59) e soro de indivíduos sadios (n=25). Os resultados foram expressos pela diferença entre as densidades óticas com o extrato citrulinado (CIT) e não citrulinado (CTR) (Delta = CIT DO405 – CTR DO405). O valor de corte foi estabelecido utilizando análise da curva ROC. Resultados: A linhagem celular humana ECV304, dentre as demais testadas, foi a única a apresentar capacidade abundante de citrulinar as próprias proteínas. Células ECV304 possuem as isoenzimas PAD2 e PAD3 e as proteínas próprias citrulinadas foram detectadas pelos autoanticorpos presentes no soro de pacientes com AR (Western Blot e ELISA). O ELISA in-house apresentou uma sensibilidade de 50% e uma especificidade de 95,2% para AR. Análise proteômica de extratos celulares citrulinados imunoprecipitados com três soros de AR identificou proteínas citrulinadas antigênicas previamente descritas em AR: calreticulina, profilina 1 e vinculina. Novos alvos citrulinados foram identificados, como: proteína 14-3-3 beta/alfa, proteína 14-3-3 zeta/delta, peroxiredoxina-5 mitocondrial e transcetolase. Conclusão: As células ECV304 expressam dois isotipos de enzimas PAD e são capazes de citrulinar proteínas próprias, que são reconhecidas por autoanticorpos no soro de AR. Essa linhagem celular representa uma ferramenta de pesquisa única para estudar a biologia e bioquímica do processo de citrulinação. Ela pode ser utilizada como fonte natural antigênica para detecção de autoanticorpos contra proteínas citrulinadas, podendo representar uma alternativa futura para o diagnóstico de AR. Pode também contribuir para estudos de inibição de citrulinação pelas drogas antirreumáticas e para medicina de precisão e personalizada através da identificação de proteínas citrulinadas alvos em diferentes estágios da doença de forma individual nos pacientes com AR. | pt_BR |
| dc.description.abstract | Citrullinated proteins contain citrullinated epitopes that are specifically recognized by anti-citrullinated protein/peptide antibodies (ACPA), one of the main autoantibody systems in rheumatoid arthritis (RA). Inflammation can promote citrullination of several proteins through an enzymatic process carried out by the enzyme peptidyl arginine deiminase (PAD), which leads to the conversion of the amino acid arginine into citrulline. ACPA are important biomarkers in RA with relevance in the pathogenesis, diagnosis and prognosis of the disease. In this work, we investigated the presence of PAD enzymes and explored the citrullination potential of the ECV304 cell line and its possible use as an antigenic substrate for immunoassays to detect ACPA in patients with RA. An in-house ELISA test was developed using ECV304 cell extract as an antigenic substrate for ACPA detection, being validated using two cohorts of RA patients and controls. Sera from RA patients with high ACPA titers were used for the determination of the ECV304 citrullinome. Objective: To characterize the ECV304 cell line in relation to its in-vitro citrullination capacity and to describe its citrullinome, for possible use as of the citrullinated cell extract antigenic substrate in an immunoassay for the detection of ACPA in patients under investigation of RA. Methods: Protein citrullination was verified by Western blot in seven human cell lines. Citrulline production was quantified by colorimetric assay. PAD enzymes, involved in the citrullination process in ECV304 cells, were identified by PCR with specific primers. Citrullinated proteins recognized by the serum of RA patients were immunoprecipitated and identified by mass spectrometry to characterize the citrullinome. An in-house ELISA system using ECV304 cell extract (citrullinated and control) was tested using serum from RA patients (n=177), serum from patients with other rheumatic diseases (non-RA) (n=59) and serum of healthy controls (n=25). The results were expressed by the difference between the optical densities from citrullinated (CIT) and non-citrullinated (CTR) extract (Delta = CIT OD405 – CTRL OD405). The cutoff value was established using ROC curve analysis. Results: The human cell line ECV304, among the others tested, was the only one to show abundant capacity to citrullinate its own proteins. ECV304 cells have the PAD2 and PAD3 isoenzymes and their own citrullinated proteins were detected by autoantibodies present in the serum of RA patients (Western Blot and ELISA). The in-house ELISA had a sensitivity of 50% and a specificity of 95.2% for RA. Proteomic analysis of citrullinated cell extracts immunoprecipitated with three RA sera identified antigenic citrullinated proteins previously described in RA: calreticulin, profilin 1 and vinculin. New citrullinated targets were identified, such as: 14-3-3 beta/alpha protein, 14-3-3 zeta/delta protein, mitochondrial peroxiredoxin-5 and transketolase. Conclusion: ECV304 cells express two isotypes of PAD enzymes and are capable of citrullinate their own proteins, which are recognized by autoantibodies in RA serum. This cell line represents a unique research tool to study the biology and biochemistry of the citrullination process. It can be used as a natural antigenic source for the detection of autoantibodies against citrullinated proteins, and may represent a future alternative for the diagnosis of RA. It can also contribute to studies of citrullination inhibition by antirheumatic drugs and to precision and personalized medicine through the identification of target citrullinated proteins at different stages of the disease individually in RA patients. | en |
| dc.emailadvisor.custom | luis.andrade@unifesp.br | |
| dc.format.extent | 153 f. | |
| dc.identifier.citation | FRANÇA, Natalia Regine de. Caracterização do autocitrulinoma das células ECV304 e sua utilização como fonte de antígenos citrulinados in vitro para detecção de autoanticorpos na artrite reumatoide. 2024. 153 f. Tese (Doutorado em Reumatologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2024. | pt_BR |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/11600/72655 | |
| dc.language | por | |
| dc.publisher | Universidade Federal de São Paulo | |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | |
| dc.subject | ECV304 | pt_BR |
| dc.subject | Artrite reumatoide | pt_BR |
| dc.subject | Anticorpos antiproteínas citrulinadas | pt_BR |
| dc.subject | Citrulinação | pt_BR |
| dc.subject | ELISA | pt_BR |
| dc.title | Caracterização do autocitrulinoma das células ECV304 e sua utilização como fonte de antígenos citrulinados in vitro para detecção de autoanticorpos na artrite reumatoide | pt_BR |
| dc.title.alternative | Characterization of ECV304 autocitrullinome and its utilization as in vitro citrullinated antigen source for autoantibodies detection in rheumatoid arthritis | en |
| dc.title.alternative | Caractérisation de l'autocitrullinome de ECV304 et son utilisation comme source d'antigène citrulliné in vitro pour la détection d'autoanticorps chez l’arthrite rhumatoïde | fr |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | |
| unifesp.campus | Escola Paulista de Medicina (EPM) | |
| unifesp.graduateProgram | Ciências da Saúde Aplicadas à Reumatologia | |
| unifesp.knowledgeArea | Fisiopatologia das Doenças Reumáticas | |
| unifesp.researchArea | Anticorpos e Outros Biomarcadores em Doenças Reumáticas |