Comparação e validação de metodologias moleculares para diagnóstico da meningite tuberculosa

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dc.contributor.advisorPignatari, Antonio Carlos Campos [UNIFESP]pt
dc.contributor.authorPalomo, Flavia Silva [UNIFESP]
dc.contributor.institutionUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)pt
dc.date.accessioned2018-07-30T11:44:09Z
dc.date.available2018-07-30T11:44:09Z
dc.date.issued2016-02-26
dc.description.abstractTuberculosis meningitis is a severe form of extrapulmonary tuberculosis, because of its high morbidity and mortality. The most common agents of this disease are the mycobacteria of the M. tuberculosis? complex. Definitive diagnosis includes smear that have low sensitivity and culture that delay in diagnosis. The use of molecular methods is promising in the diagnosis of this disease, since they are fast with high, sensitivity and specificity. This study aimed to compare and to validate molecular protocols (PCR) for the diagnosis of tuberculosis meningitis directly from CSF samples including the mycobacterium DNA extraction techniques and targets for PCR amplification. Methods: For comparison and validation of molecular protocols we used positive control group (CSF pools known negative and infected with ATCC M. tuberculosis), negative control group and clinical CSF samples. Four DNA extraction techniques (Phenol-Chloroform-Thiocyanate guanidine, Thiocyanate-Silica guanidine, Resin and Resin with ethanol) were compared. Also, the negative and positive control groups and CSF samples were used to determine the best target (IS6110, and MPB64 hsp65KDa) for diagnosis of tuberculosis meningitis. For statistical analyzes the CSF samples were classified as true positive and negative. For this classification a survey in the site TBweb was done with analysis of laboratory data and medical records of patients. Results: The extraction protocol using the phenol chloroform-thiocyanate guanidine showed the best results in terms of quantification and sensitivity of PCR amplification, presenting up to 10 times more DNA than the second best (silica guanidine thiocyanate). The targets that showed the best amplification results was the the IS6110, with a good agreement (0.64 ?) in conventional PCR and moderate (0.54 ?) in real-time PCR. The sensitivity and specificity were, respectively, 100 % and 79 % for the real-time PCR method and 94 % and 87 % for conventional, when compared to culture. The sample analysis for IS6110 real-time PCR amplification showed a 91% sensitivity, 97% specificity and optimal agreement (0.89 ? ) with the clinical diagnosis . When this analysis was grouped by patient, we showed a sensitivity of 100 % , specificity of 98 % and a very good agreement ( ? 0.96 ) with the clinical diagnosis. Conclusion: A protocol using extraction with phenol chloroform and guanidine thiocyanate, followed by amplification of the IS6110 target for real time PCR in house showed to be suitable for molecular diagnosis of tuberculosis meningitis in our clinical setting.en
dc.description.abstractA meningite tuberculosa é uma forma grave de tuberculose extrapulmonar e apresenta altas taxas de morbi-mortalidade. Os agentes mais comuns dessa doença são as micobactérias do complexo M. tuberculosis. O diagnóstico definitivo inclui a baciloscopia, que apresenta baixa sensibilidade e a cultura requer tempo de incubação prolongado. A utilização de métodos moleculares tem apresentado maior rapidez, sensibilidade e especificidade. Esse estudo teve como objetivo comparar e validar protocolos moleculares (PCR) para o diagnóstico da meningite tuberculosa diretamente de amostras de LCR, desde as técnicas de extração de DNA micobacteriano até o alvo para amplificação na PCR. Métodos: Para comparação e validação dos protocolos moleculares foram utilizados grupos controles positivos (amostras de LCR sabidamente negativos e contaminados com ATCC de M. tuberculosis), negativos e amostras de LCR. Quatro técnicas de extração de DNA (Fenol-Clorofórmio-Tiocianato de guanidina, Sílica-tiocianato de guanidina, Resina e Resina com etanol) foram comparadas. Além disso, o grupo controle negativo, positivo e amostras de LCR foram utilizados para determinar o melhor alvo (IS6110, hsp65KDa e MPB64) e melhor técnica (PCR convencional ou em tempo real) para diagnóstico da meningite tuberculosa. Para as análises estatísticas as amostras de LCR foram classificadas como verdadeiras positivas e negativas. Para essa classificação foi realizado um levantamento na TBweb, análise dos dados laboratoriais e prontuário dos pacientes. Resultados: O protocolo de extração que utilizou o fenol clorofórmio-tiocianato de guanidina foi o que apresentou melhores resultados quanto a quantificação e sensibilidade de amplificação pela PCR, apresentando até 10 vezes mais DNA que o segundo melhor (sílica-tiocianato de guanidina). Quanto aos alvos, não houve diferenças significativas no grupo controle positivo, já para as amostras clínicas e grupo controle negativo o IS6110 foi o que apresentou melhores resultados, tendo uma concordância boa (0,64 ?) na PCR convencional e moderada (0,54 ?) na PCR em tempo real. Os valores de sensibilidade e especificidade foram respectivamente, de 100% e 79% para a metodologia da PCR em tempo real e 94% e 87% para a PCR convencional, quando comparada à cultura. Na análise de amostra por teste o alvo IS6110 amplificado pela PCR em tempo real apresentou uma sensibilidade de 91%, especificidade de 97% e concordância ótima (0,89 ?) com o diagnóstico clínico. Quando agrupamos essa análise por paciente, observamos que esse alvo apresentou uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 98% e uma concordância ótima (0,96 ?) com o diagnóstico clínico. Conclusão: O protocolo utilizando a extração com uso de fenol clorofórmio e tiocianato de guanidina, seguido pela amplificação do alvo IS6110 por PCR em tempo real in house demonstrou ser adequado para o diagnóstico molecular da meningite tuberculosa em nossa casuística.pt
dc.description.sourceDados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016)
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.format.extent83 p.
dc.identifierhttps://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4988577pt
dc.identifier.citationPALOMO, Flavia Silva. Comparação e validação de metodologias moleculares para diagnóstico da meningite tuberculosa. 2016. 83 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
dc.identifier.fileFLAVIA SILVA PALOMO.pdf
dc.identifier.urihttps://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47268
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.subjectmeningite tuberculosaen
dc.subjectdiagnóstico molecularen
dc.subjectpcren
dc.subjectcomplexo mycobacterium tuberculosisen
dc.subjectmeningite tuberculosapt
dc.subjectdiagnóstico molecularpt
dc.subjectpcrpt
dc.subjectcomplexo mycobacterium tuberculosispt
dc.titleComparação e validação de metodologias moleculares para diagnóstico da meningite tuberculosapt
dc.title.alternativeComparison and Validation of Molecular Methodology to Diagnosis of Meningeal Tuberculosisen
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/masterThesis
unifesp.campusSão Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM)pt
unifesp.graduateProgramInfectologiapt
unifesp.knowledgeAreaCiências da saúdept
unifesp.researchAreaMedicinapt
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