Novo sistema in situ para análise da proteólise muscular esquelética: papel da via do AMP cíclico
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Data
2010-10-27
Autores
Bergantin, Leandro Bueno 
Orientadores
Godinho, Rosely Oliveira
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
In vertebrates, skeletal muscle contributes to the control of body energy homeostasis by providing amino acids generated from protein breakdown. However, continued muscle protein breakdown results in muscle atrophy, such as those associated with aging, muscle wasting or neuromuscular dysfunction. The molecular mechanisms involved in regulation of muscle proteolysis as well as the pharmacological screening of drugs that interfere in this process have been addresses by measurement of tyrosine release from muscles of prepubertal rats, because they are thin enough to allow an adequate diffusion of oxygen and substrates under in vitro conditions. Therefore, the effect of aging or neurodegenerative diseases has been analyzed only with static markers, as atrogin-1/MAFbx or Murf-1. The aim of the present study was the establishment of a new in situ experimental model for the dynamic measurement of proteolysis in adult rat muscles, by quantifying the release of tyrosine from the lumbricalis muscle. In addition, the fluorimetric macromethod for tyrosine measurement was adapted for 96 wells microplate, which resulted in 90% reduction in the formation of toxic chemical waste. The results were complemented by analyzing the effect of modulators of Gs protein / adenylyl cyclase / cyclic AMP signaling pathway on proteolysis of adult muscles, whose influence had already been demonstrated in muscles from prepubertal rat. Using adult rat lumbricalis muscle, we found that modulators of the cAMP signaling pathway inhibit muscle proteolysis under basal or catabolic condition induced by denervation. â-adrenergic agonists isoproterenol (30-100 mM; non-selective) and formoterol (1-10 nM; selective â2), the adenylyl cyclase activator forskolin (30-100 nM) and nonselective phosphodiesterase inhibitor IBMX (100-1000 mM) reduced by 12% to 20% muscle proteolysis. Furthermore, our results show that muscle proteolysis in pre-pubertal rats (30 days old) is 94% higher than in adult animals, which makes questionable the direct extrapolation of results obtained from pre-pubertal muscles to adult or senile muscles. The use of lumbricalis muscle as an proteolysis experimental model reduces by 75% the number of animals in proteolysis experimental protocols and by 90% the amount of chemical waste produced, due to the adjustment of the dosage of tyrosine to 96 well microplate, optimizing the pharmacological screening of drugs for anticatabolic purposes.
O músculo esquelético de mamífero é responsável tanto pelo desencadeamento da contração e geração de força e movimento. Por outro lado, o músculo participa do controle da homeostase energética corporal ao disponibilizar aminoácidos gerados a partir da proteólise muscular. A regulação final dessa proteólise é crucial para a manutenção da massa muscular. Até o momento, os mecanismos de regulação desse processo assim como a triagem farmacológica de drogas que interferem com a proteólise muscular tem sido realizadas pela medida da liberação de tirosina de músculos de ratos impúberes, devido ao tamanho e à má perfusão tecidual de músculos de ratos adultos. Logo, o efeito da idade ou de doenças neurodegenerativas tem sido analisado apenas com marcadores estáticos, como atrogin*1/MAFbx ou Murf*1. Além disso, músculos de ratos impúberes diferem daqueles do rato adulto quanto a resistência à insulina e alta taxa de crescimento, o que pode comprometer a extrapolação direta dos resultados obtidos em animais impúberes para adultos. No presente estudo, propusemos o estabelecimento de um novo modelo experimental in situ o músculo lumbricalis do rato adulto para a medida dinâmica da proteólise muscular, através da quantificação da liberação de tirosina pelo músculo. Além disso, adaptamos o método fluorimétrico da medida do aminoácido para microplaca de 96 fossos, o que implicou na redução de 90% da formação de rejeitos químicos. Esse estudo foi complementado pela análise do efeito de moduladores da via da proteína Gs/Adenilil ciclase/ AMP cíclico, cuja participação na regulação da proteólise muscular já havia sido demonstrada em músculos de ratos impúberes. Utilizando o músculo lumbricalis de rato adulto, comprovamos que moduladores da via de sinalização do AMPc inibem a proteólise muscular em situações basais ou catabólicas induzidas pela desnervação. Os agonistas de adrenoceptores β isoproterenol (30*100 ]M; não seletivo) e formoterol (1*10 nM; seletivo β2), o ativador de adenilil ciclase forscolina (30*100 nM) e o inibidor não seletivo de fosfodiesterases IBMX (100*1000]M) reduziram a proteólise muscular em 12a20%. Além disso, evidenciamos que a proteólise muscular de ratos impúberes (30dias de idade) é 94% maior que a de animais adultos, resultado que torna questionável a extrapolação de resultados obtidos em músculos de animais impúberes para a idade adulta. A utilização do músculo lumbricalis como modelo experimental reduz em pelo menos 4 vezes o número de animais em protocolos experimentais de medida de proteólise e em 90% a quantidade de rejeitos químicos produzidos, devido à adaptação da dosagem da tirosina para microplaca, propiciando a realização de triagem farmacológica de drogas para fins terapêuticos anticatabólicos.
O músculo esquelético de mamífero é responsável tanto pelo desencadeamento da contração e geração de força e movimento. Por outro lado, o músculo participa do controle da homeostase energética corporal ao disponibilizar aminoácidos gerados a partir da proteólise muscular. A regulação final dessa proteólise é crucial para a manutenção da massa muscular. Até o momento, os mecanismos de regulação desse processo assim como a triagem farmacológica de drogas que interferem com a proteólise muscular tem sido realizadas pela medida da liberação de tirosina de músculos de ratos impúberes, devido ao tamanho e à má perfusão tecidual de músculos de ratos adultos. Logo, o efeito da idade ou de doenças neurodegenerativas tem sido analisado apenas com marcadores estáticos, como atrogin*1/MAFbx ou Murf*1. Além disso, músculos de ratos impúberes diferem daqueles do rato adulto quanto a resistência à insulina e alta taxa de crescimento, o que pode comprometer a extrapolação direta dos resultados obtidos em animais impúberes para adultos. No presente estudo, propusemos o estabelecimento de um novo modelo experimental in situ o músculo lumbricalis do rato adulto para a medida dinâmica da proteólise muscular, através da quantificação da liberação de tirosina pelo músculo. Além disso, adaptamos o método fluorimétrico da medida do aminoácido para microplaca de 96 fossos, o que implicou na redução de 90% da formação de rejeitos químicos. Esse estudo foi complementado pela análise do efeito de moduladores da via da proteína Gs/Adenilil ciclase/ AMP cíclico, cuja participação na regulação da proteólise muscular já havia sido demonstrada em músculos de ratos impúberes. Utilizando o músculo lumbricalis de rato adulto, comprovamos que moduladores da via de sinalização do AMPc inibem a proteólise muscular em situações basais ou catabólicas induzidas pela desnervação. Os agonistas de adrenoceptores β isoproterenol (30*100 ]M; não seletivo) e formoterol (1*10 nM; seletivo β2), o ativador de adenilil ciclase forscolina (30*100 nM) e o inibidor não seletivo de fosfodiesterases IBMX (100*1000]M) reduziram a proteólise muscular em 12a20%. Além disso, evidenciamos que a proteólise muscular de ratos impúberes (30dias de idade) é 94% maior que a de animais adultos, resultado que torna questionável a extrapolação de resultados obtidos em músculos de animais impúberes para a idade adulta. A utilização do músculo lumbricalis como modelo experimental reduz em pelo menos 4 vezes o número de animais em protocolos experimentais de medida de proteólise e em 90% a quantidade de rejeitos químicos produzidos, devido à adaptação da dosagem da tirosina para microplaca, propiciando a realização de triagem farmacológica de drogas para fins terapêuticos anticatabólicos.
Descrição
Citação
BERGANTIN, Leandro Bueno. Novo sistema in situ para análise da proteólise muscular esquelética: papel da via do AMP ciclíco. 2010. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.