Aplicação da técnica de pcr em tempo real na identificação microbiana e detecção de genes de resistência a antimicrobianos em episódios de bacteremia de pacientes pediátricos com câncer
Data
2014-04-11
Autores
Carlesse, Fabianne Altruda de Moraes Costa 
Orientadores
Pignatari, Antonio Carlos Campos Pignatari
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Background: Bloodstream infections (BSI) are major cause of infection-related mortality in patients with cancer. Phenotipic methods are utilized to detect and to identify pathogens in blood stream cultures but with slow time for positivity and final results. Molecular techniques have been utilized for a quick ethiologic diagnosis of blood stream infections allowing the institution of an early adequate therapy improving patients survival rates. Aim: To evaluate if the Real Time PCR method used to identify the main pathogens causing blood stream infections and some important antimicrobial resistance genes causing bloodstream infections could improve the early diagnosis and adequate therapy in oncology pediatric patients. Methods: During March 2010 to March 2012 we conducted a retrospective study at the Oncology Pediatric Institute (IOP-GRAACC-Brazil). The blood stream samples were incubated in the automated Bactec® system and the microbal identification and susceptibility tests were done in the automated Phoenix® system. We included 81 blood positive blood stream samples that were submitted to molecular analysis. Polimicrobial infections were excluded, 69 BSI were analysed in 64 patients. Samples from the blood stream bottles were submitted to molecular tests by Real Time PCR with specific Gram probes, 17 specific gender sequences and antimicrobial resistance genes blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA.The adequacy of the antimicrobial therapy was evaluated at the time of the Gram stain result from the positive blood bottle (time 1) and in the available final phenotypic result for the assistant physician (time 2). Results: Gram positive bacteria were identified in 61% of the samples, Gram negative bacteria in 32% and fungi in 7%. There was agreement in 82,6% for the initial Gram stain and 78,2% in the final species identification between the phenotipic and molecular methods. The mecA gene was detected in 81,4% of Staphylococcus spp, and was 91,6% concordant with the phenotypic method. Detection of vanA gene was 100% concordant. For Gram negative bacteria the concordance was 71,4% for Enterobacteriacea and 50% for Pseudomonas aeruginosa. Therapy was inadequate particularly in patients who died (5/6). The molecular tests was concordant in 50% of theses cases. Conclusion: Real Time PCR could be useful in the early identification of pathogens and antimicrobial resistance genes in bloodstream infections of pediatric oncologic patients and could contribute to improve the antimicrobial therapy.
Introdução: A infecção da corrente sanguínea (ICS) é apontada como a infecção microbiológica mais comum entre os pacientes com câncer e está associada diretamente a letalidade. Métodos fenotípicos são utilizados para a detecção e identificação de patógenos na corrente saguínea, com um tempo longo para a positividade e particularmente para o resultado final. Técnicas moleculares têm sido utilizadas possibilitando um diagnóstico etiológico rápido dessas infecções, proporcionando a introdução da terapêutica adequada precocemente, e melhorando as taxas de sobrevida. Objetivo: Avaliar a contribuição da técnica de PCR em Tempo Real para o diagnóstico precoce dos principais agentes etiológicos em ICS e dos genes de resistência aos antimicrobianos comparando com o método fenotípico e avaliar a contribuição da técnica molecular para adequação terapêutica em pacientes oncológicos pediátricos. Métodos: Estudo restropectivo, realizado no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP/GRAACC/UNIFESP), São Paulo, Brasil. Foram incluídos 81 episódios de ICS com hemoculturas positivas que tiveram concomitante análise molecular. As ICS polimicrobianas foram excluídas, sendo analisados 69 ICS monomicrobianas. As hemoculturas foram incubadas no sistema automatizado Bactec® e a identificação microbiana e teste de sensibilidade a antimicrobianos foi realizada sistema automatizado Phoenix®. Foram coletadas amostras dos frascos de hemocultura para a análise molecular por PCR em tempo real por sondas Gram específicas, 17 sequências gênero específicas e genes de resistência blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA. A adequação da terapêutica antimicrobiana foi avaliada ecomparada aos testes moleculares no momento do resultado da coloração de Gram dos frascos de hemocultura (momento 1) e quando o resultado fenotípico final foi disponibilizado ao médico assistente (momento 2). Resultados: Bactérias Gram positivas foram identificadas em 61% das hemoculturas, bactérias Gram negativas em 32% e fungos em 7%. Houve concordância em 82,6% para identificação pela coloração de Gram e de 78,2% na identificação final de espécie microbiana entre os métodos fenotípico e molecular. O gene mecA foi detectado em 81,4% dos Staphylococcus spp, concordando em 91,6% com o teste fenotípico. A detecção do gene vanA foi 100% concordante. Entre as bactérias Gram negativas houve 71,4% de concordância para enterobactérias e 50% para Pseudomonas aeruginosa. Observamos uma proporção de inadequação antimicrobiana no momento 1 particularmente nos pacientes que foram a óbito.O teste molecular concordou com a identificação do agente em 50% desses episódios. Conclusões: O método molecular de PCR em Tempo Real direto dos frascos de hemocultura foi útil na identificação de patógenos e genes de resistência a antimicrobianos nas ICS em pacientes de oncologia pediátrica, podendo contribuir para uma melhor adequação da terapia antimicrobiana.
Introdução: A infecção da corrente sanguínea (ICS) é apontada como a infecção microbiológica mais comum entre os pacientes com câncer e está associada diretamente a letalidade. Métodos fenotípicos são utilizados para a detecção e identificação de patógenos na corrente saguínea, com um tempo longo para a positividade e particularmente para o resultado final. Técnicas moleculares têm sido utilizadas possibilitando um diagnóstico etiológico rápido dessas infecções, proporcionando a introdução da terapêutica adequada precocemente, e melhorando as taxas de sobrevida. Objetivo: Avaliar a contribuição da técnica de PCR em Tempo Real para o diagnóstico precoce dos principais agentes etiológicos em ICS e dos genes de resistência aos antimicrobianos comparando com o método fenotípico e avaliar a contribuição da técnica molecular para adequação terapêutica em pacientes oncológicos pediátricos. Métodos: Estudo restropectivo, realizado no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP/GRAACC/UNIFESP), São Paulo, Brasil. Foram incluídos 81 episódios de ICS com hemoculturas positivas que tiveram concomitante análise molecular. As ICS polimicrobianas foram excluídas, sendo analisados 69 ICS monomicrobianas. As hemoculturas foram incubadas no sistema automatizado Bactec® e a identificação microbiana e teste de sensibilidade a antimicrobianos foi realizada sistema automatizado Phoenix®. Foram coletadas amostras dos frascos de hemocultura para a análise molecular por PCR em tempo real por sondas Gram específicas, 17 sequências gênero específicas e genes de resistência blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA. A adequação da terapêutica antimicrobiana foi avaliada ecomparada aos testes moleculares no momento do resultado da coloração de Gram dos frascos de hemocultura (momento 1) e quando o resultado fenotípico final foi disponibilizado ao médico assistente (momento 2). Resultados: Bactérias Gram positivas foram identificadas em 61% das hemoculturas, bactérias Gram negativas em 32% e fungos em 7%. Houve concordância em 82,6% para identificação pela coloração de Gram e de 78,2% na identificação final de espécie microbiana entre os métodos fenotípico e molecular. O gene mecA foi detectado em 81,4% dos Staphylococcus spp, concordando em 91,6% com o teste fenotípico. A detecção do gene vanA foi 100% concordante. Entre as bactérias Gram negativas houve 71,4% de concordância para enterobactérias e 50% para Pseudomonas aeruginosa. Observamos uma proporção de inadequação antimicrobiana no momento 1 particularmente nos pacientes que foram a óbito.O teste molecular concordou com a identificação do agente em 50% desses episódios. Conclusões: O método molecular de PCR em Tempo Real direto dos frascos de hemocultura foi útil na identificação de patógenos e genes de resistência a antimicrobianos nas ICS em pacientes de oncologia pediátrica, podendo contribuir para uma melhor adequação da terapia antimicrobiana.
Descrição
Citação
CARLESSE, Fabianne Altruda de Moraes Costa. Aplicação da técnica de pcr em tempo real na identificação microbiana e detecção de genes de resistência a antimicrobianos em episódios de bacteremia de pacientes pediátricos com câncer. 2014. 210 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.