Estudo de propriedades biofísicas de vesículas unilamelares gigantes como modelo para entrega intracelular de materiais: eletroporação e fusão de membranas
| dc.contributor.advisor | Riske, Karin Do Amaral [UNIFESP] | pt_BR |
| dc.contributor.advisorLattes | http://lattes.cnpq.br/9178927522709552 | pt_BR |
| dc.contributor.author | Lira, Rafael Bezerra de [UNIFESP] | |
| dc.contributor.authorLattes | http://lattes.cnpq.br/9253308829387337 | pt_BR |
| dc.contributor.institution | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) | pt_BR |
| dc.coverage.spatial | São Paulo | pt_BR |
| dc.date.accessioned | 2018-07-30T11:44:08Z | |
| dc.date.available | 2018-07-30T11:44:08Z | |
| dc.date.issued | 2016-11-30 | |
| dc.description.abstract | Biological membranes are the structures that define the boundaries of cells, acting as a selective barrier, regulating the intra and extracellular transport. Many biological substances have their target in the cell?s interior, but are not able to cross the membrane to reach them. Therefore, many methods for the intracellular delivery of materials have been developed; among them, electroporation and fusogenic liposomes. During electroporation, one or more intense electrical pulses are applied and the membrane becomes transiently permeable, allowing the entry of the substances into the cell. The method is efficient but has high toxicity. The fusion between liposomes and cells results in the delivery of the liposome-encapsulated substance, but the underlying mechanisms are not well known and the efficiency is limited. Biomimetic models are generally employed to mimic real systems in a controlled way. One of the most common biomimetic system are the giant unilamellar vesicles (GUVs). In this thesis, we use GUVs with mixed the zwitterionic (PC) and anionic (PG) lipids to study the processes of electroporation and fusion with fusogenic liposomes, and both processes are studied by a series of microscopy-based techniques. Electroformed pores in electrically neutral GUVs are transient, with a pore lifetime in the order of a few milliseconds. In contrast, electroformed pores in some negatively charged GUVs open indefinitely, leading to a total vesicle collapse, in a process termed bursting. The results presented here show that the bursting fraction depends on the fraction of PG in the membrane, lipid insaturation (lipids with insaturation in one or both hydrophobic tails) e certain additives in the medium, especially Ca+2. Bursting propensity is related to the reduction n pore edge tension (?), from 57,9±26,1 e 53,7±11,5 pN in neutral POPC and DOPE membranes, respectively, to values lower than 20 pN in membranes containing PG ? 20 mol%. Such a reduction also depends on the presence of médium additives, and the ? values are higher for vesicles in the presence of Ca+2 compared to Na+, but only in the presence of PG ? 20 mol%. Destabilization propensity is, therefore, a result of a reduction in ?. Formed pores in charged membranes have a composition similar to that in intact membranes. Reminiscent pores after GUV electroporation have a higher permeability to macromolecules. Negative membranes also display differences in other membrane properties compared to neutral ones, such as reduction in lipid mobility, increase in membrane order and spontaneous curvature. The fusion of GUVs with different fractions of PG in PC membranes, with fusogenic liposomes, was studied in a new LUV-GUV fusogenic system, in which fusion was observed in real time and its effects directly observed and quantified under the microscope. In this system, many fusion intermediates (adhesion, hemifusion and full-fusion) can be detected and the morphological transformations directly observed. Förster resonance energy transfer (FRET) assays allow to measure the amount of lipids transferred from the LUVs to the GUVs, and show that the transition hemifusion6 full fusion occurs in the range of 10-20 mol% PG. At low PG mol fractions (? 10 mol%), the interaction leads mainly to adhesion and hemifusion and increases membrane tension, whereas at high PG mol fractions (? 20 mol%), the interaction results in full fusion, leading to GUV increase in area. The construction of a FRET calibration curve allows the determination of the final membrane composition after fusion in every GUV. During hemifusion, the amount of cationic lipids transferred fro LUVs is < 5 mol%, whereas upon full fusion, the final GUV composition contains up to 20 mol% DOTAP. In every case, fusion occurs by a charge neutralization mechanism. The results presented here (i) clarifies the responsible mechanisms of bursting of negatively charged GUVs, (ii) define the membrane charge determinants of fusion in a system of membranes with opposite charges and, (iii) show that many properties of electrically membranes are distinct from their neutral counterparts. We believe that the findings presented here may help on the development of better delivery systems, with better efficiency and lower side effects. | en |
| dc.description.abstract | As membranas são as estruturas que definem os limites das células, atuando como uma barreira seletiva e regulando o transporte intra e extracelular. Várias substâncias biológicas têm seu alvo no interior da célula, mas não conseguem atravessar as membranas e alcançá-los. Portanto, vários métodos de entrega intracelular de materiais vêm sendo desenvolvidos; entre eles a eletroporação e lipossomas fusogênicos. Na eletroporação, um ou mais pulsos elétricos intensos são aplicados e a membrana plasmática se torna transientemente permeável, permitindo a entrada de substâncias na célula. O método é eficiente mas apresenta elevada toxicidade. A fusão entre lipossomas e células resulta na entrega da substância encapsulada nos lipossomas, mas os mecanismos são pouco conhecidos e a eficiência é limitada. Modelos biomiméticos são geralmente empregados para simular sistemas reais de forma controlada. Um dos sistemas biomiméticos de membranas mais utilizados são as vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Nesta tese, são usadas GUVs de lipídeos zwiteriônicos (PC) e misturas com lipídeos aniônicos (PG) para estudar processos de eletroporação e fusão com lipossomas fusogênicos, e ambos os processos são estudados por uma série de técnicas microscópicas. Poros eletroformados em GUVs eletricamente neutras são transientes, com tempo de vida de poucas centenas de milissegundos. Em contraste, poros formados em algumas GUVs negativas abrem indefinidamente, levando ao total colapso da vesícula, num processo batizado de bursting. Os resultados aqui mostram que a fração de bursting depende da fração de PG na membrana, do grau de insaturação nos lipídeos (lipídeos com insaturação em uma ou ambas as caudas hidrofóbicas) e de determinados aditivos do meio, especialmente o Ca2+. A propensão ao bursting está relacionada à redução da tensão de linha do poro (?), de 57,9±26,1 e 53,7±11,5 pN em membranas neutras de POPC e DOPC, respectivamente, para valores menores que 20 pN em membranas contendo frações de PG ? 20 mol%. Tal redução também depende da presença de determinados aditivos no meio, com valores de ? mais elevados na presença de Ca+2 relativo a Na+, mas apenas para PG ? 20 mol%. A propensão à desestabilização é, portanto, resultado da redução de ?. Poros formados membranas carregadas têm composição similar às regiões de membranas íntegra, independente da carga de membrana. Poros remanescentes após eletroporação de GUVs negativas apresentam permeabilidade a macromoléculas. Membranas negativas também apresentam diferenças em outras propriedades de membrana comparadas a membranas neutras, como redução na mobilidade de lipídeos, aumento da ordem e da curvatura espontânea. A fusão de GUVs com diferentes frações de PG em membranas de PC, com lipossomas catiônicos fusogênicos, foi estudada num novo sistema fusogênico LUV-GUV, em que a fusão foi observada em tempo real e seus efeitos diretamente observados e quantificados no microscópio. Nesse sistema, vários dos intermediários de fusão (adesão, hemifusão e fusão completa) podem ser 4 detectados e as transformações morfológicas de membrana são observadas diretamente. Ensaios de Transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) permitem medir a quantidade de lipídeos transferidos das LUVs para GUVs, e mostraram que a transição hemifusão-fusão completa ocorre para faixas de PG 10-20 mol%. A baixas frações molares de PG (? 10 mol%), a interação resulta primariamente em adesão e hemifusão, aumentando a tensão de membrana, enquanto a elevadas frações (? 20 mol%), a interação resulta em fusão completa, levando ao aumento de área das GUVs. A construção de uma curva de calibração FRET permite determinar a composição da membrana após fusão em cada GUV individualmente. Durante hemifusão, a quantidade de lipídeo catiônico transferido das LUVs é < 5 mol%, enquanto a fusão completa em composição final contendo até 20 mol% desse lipídeo. Em todos os casos, a fusão se dá por neutralização de cargas. Os resultados apresentados aqui (i) esclarecem os mecanismos responsáveis pelo processo de bursting de GUVs negativas, (ii) definem os determinantes de carga de membrana de GUVs num sistema de fusão de membranas de cargas opostas, e (iii) mostram que várias propriedades de membranas eletricamente carregadas são distintas daquelas em membranas neutras. Nós acreditamos que esses achados devem ajudar o desenvolvimento de sistemas de entrega intracelular de forma mais eficiente com o mínimo de efeitos adversos. | pt_BR |
| dc.description.source | Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016) | |
| dc.description.sponsorship | Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) | pt_BR |
| dc.format.extent | 188 F. | |
| dc.identifier | https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4045018 | pt_BR |
| dc.identifier.citation | LIRA, Rafael Bezerra de. Estudo de propriedades biofísicas de vesículas unilamelares gigantes como modelo para entrega intracelular de materiais: eletroporação e fusão de membranas. 2016. 188 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016. | |
| dc.identifier.file | Rafael Bezerra de Lira - PDF A.pdf | |
| dc.identifier.uri | http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47260 | |
| dc.language.iso | por | |
| dc.publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) | |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | |
| dc.subject | Membranes | en |
| dc.subject | Electroporation | en |
| dc.subject | Fusion | en |
| dc.subject | Line voltage | en |
| dc.subject | Fret | en |
| dc.subject | Guvs | en |
| dc.subject | Optical microscopy | en |
| dc.subject | Membranas | pt_BR |
| dc.subject | Eletroporação | pt_BR |
| dc.subject | Fusão | pt_BR |
| dc.subject | Tensão de linha | pt_BR |
| dc.subject | Fret | pt_BR |
| dc.subject | Guvs | pt_BR |
| dc.subject | Microscopia ótica | pt_BR |
| dc.title | Estudo de propriedades biofísicas de vesículas unilamelares gigantes como modelo para entrega intracelular de materiais: eletroporação e fusão de membranas | pt_BR |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | |
| unifesp.campus | São Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM) | pt_BR |
| unifesp.graduateProgram | Ciências Biológicas (Biologia Molecular) | pt_BR |
| unifesp.knowledgeArea | Ciências biológicas | pt_BR |
| unifesp.researchArea | Bioquímica | pt_BR |
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