Caracterização molecular dos mecanismos de resistência às polimixinas em isolados ambientais de Klebsiella variicola
Data
2020-05-28
Autores
Pinto, Michael Henrique Lenzi 
Orientadores
Gales, Ana Cristina
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Polymyxins are cationic compounds used as last-resort treatment of multiresistant gram-negative bacteria. The bactericidal action of polymyxins occurs when there is an electrostatic interaction between the positive charge of polymyxins and the negative charge of lipid A. The return to use of polymyxins in clinical treatment and continued use in veterinary medicine has caused an increase in reports of bacteria resistant to these compounds, especially in the hospital settings. Lipid A modification is the main mechanism of resistance polymyxin resistance phenotype. These modifications can be mediated chromosome via two-component systems (TCS), or via mobile elements MCR protein. This study aims to investigate isolates of polymyxins resistant Klebsiella variicola from migratory birds and to characterize the mechanisms responsible for this phenotype. A total of 339 gram-negative microorganisms were selected from of environmental samples from migratory birds collected at the Zoo of São Paulo in 2012. The polymyxin resistant gram-negative isolates from natural sources were identified by MALDI-TOF MS. Bacterials belonging to the same species K. variicola were analized to genetic similarity analysis by PFGE. After, the susceptibility profile to the other antimicrobials was determined by the dilution agar technique and interpreted following EUCAST/BrCAST guidelines. K. variicola isolates were to submit to detection of polymyxin resistance factors by phenotypic and molecular technique, followed by membrane load analysis. To the characterization the genes responsible for polymyxin resistance, the Whole Genome Sequencing (WGS) was performed by Illumina MiSeq methodology. Three polymyxins resistants K. variicola isolates (M14, M15 and M50) were identified. Among these, it was possible to visualize two different clonal groups, where M15 is a subclone of M14 and M50 a different clone. MLST analysis showed that M14 and M15 belong to ST137 and M50 to ST167. Susceptibility tests have shown that the three isolates are susceptible to all antimicrobials tested except polymyxins. There was no detection of mcr gene variants in these isolates. WSG analysis demonstrated mutations that cause protein change in genes responsible for polymyxin resistance in K. pneumoniae (mgrB, phoQ and pmrB). These same genes showed high transcriptional levels observed in the qRT-PCR demonstrating correlation with polymyxin resistance in the three isolates.
As polimixinas são compostos catiônicos utilizados como antimicrobianos de última escolha no tratamento de bactérias gram-negativas multirresistentes. A ação bactericida das polimixinas ocorre quando há uma interação eletrostática entre a carga positiva das polimixinas e a carga negativa do lipídeo A. O retorno da utilização das polimixinas na prática clínica e a continua utilização na medicina veterinária têm causado um aumento nos relatos de bactérias resistentes a esses compostos, principalmente no ambiente hospitalar. Para o estabelecimento do fenótipo de resistência às polimixinas destaca-se a modificação do lipídeo A, como o principal mecanismo de resistência a estes compostos. Essas modificações podem ser mediadas via cromossômica através de sistemas de dois componentes (SDC), ou via proteína MCR que apresenta localização plasmidial. O presente estudo tem como objetivo investigar isolados de Klebsiella variicola resistentes às polimixinas oriundos de aves migratórias e caracterizar os mecanismos responsáveis por esse fenótipo. Um total de 339 micro-organismos gram-negativos foi selecionado a partir de um banco de amostras ambientais provenientes de aves migratórias coletadas no Parque Zoológico de São Paulo em 2012. Os isolados bacterianos gram-negativos resistentes às polimixinas provenientes de fontes naturais foram identificados por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos pertencentes à mesma espécie K. variicola, foram submetidos a análise de similaridade genética por PFGE. Posteriormente, o perfil de sensibilidade aos demais antimicrobianos foi determinado pela técnica de ágar diluição, exceto a polimixina B que foi determinado através de microdiluição em caldo, ambas técnicas foram interpretadas seguindo recomendações do EUCAST/BrCAST. Os isolados de K. variicola foram submetidos a detecção de fatores de resistência às polimixinas por técnica fenotípica e molecular, seguido de análise de carga de membrana. A fim da caracterização dos genes responsáveis pela resistência às polimixinas, o sequenciamento do genoma completo (WGS) foi realizado pela metodologia Illumina MiSeq. Foram identificados três isolados de K. variicola resistentes às polimixinas (M14, M15 e M50). Dois grupos clonais diferentes visualizados, sendo que M15 é um subclone de M14 e M50 um clone diferente. Análise de MLST demonstrou que M14 e M15 pertencem ao ST2362 e M50 ao ST3125. Testes de sensibilidade demonstraram que os três isolados são sensíveis a todos antimicrobianos testados, exceto às polimixinas. Não houve detecção de variantes do gene mcr nestes isolados. Análise de WSG demonstrou mutações com alteração de proteína em genes responsáveis por resistência às polimixinas em K. pneumoniae (mgrB, phoQ e pmrB). Estes mesmos genes apresentaram elevados níveis transcricionais observados na técnica de qRT-PCR demonstrando a relação dos mesmos e a resistência nos três isolados.
As polimixinas são compostos catiônicos utilizados como antimicrobianos de última escolha no tratamento de bactérias gram-negativas multirresistentes. A ação bactericida das polimixinas ocorre quando há uma interação eletrostática entre a carga positiva das polimixinas e a carga negativa do lipídeo A. O retorno da utilização das polimixinas na prática clínica e a continua utilização na medicina veterinária têm causado um aumento nos relatos de bactérias resistentes a esses compostos, principalmente no ambiente hospitalar. Para o estabelecimento do fenótipo de resistência às polimixinas destaca-se a modificação do lipídeo A, como o principal mecanismo de resistência a estes compostos. Essas modificações podem ser mediadas via cromossômica através de sistemas de dois componentes (SDC), ou via proteína MCR que apresenta localização plasmidial. O presente estudo tem como objetivo investigar isolados de Klebsiella variicola resistentes às polimixinas oriundos de aves migratórias e caracterizar os mecanismos responsáveis por esse fenótipo. Um total de 339 micro-organismos gram-negativos foi selecionado a partir de um banco de amostras ambientais provenientes de aves migratórias coletadas no Parque Zoológico de São Paulo em 2012. Os isolados bacterianos gram-negativos resistentes às polimixinas provenientes de fontes naturais foram identificados por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos pertencentes à mesma espécie K. variicola, foram submetidos a análise de similaridade genética por PFGE. Posteriormente, o perfil de sensibilidade aos demais antimicrobianos foi determinado pela técnica de ágar diluição, exceto a polimixina B que foi determinado através de microdiluição em caldo, ambas técnicas foram interpretadas seguindo recomendações do EUCAST/BrCAST. Os isolados de K. variicola foram submetidos a detecção de fatores de resistência às polimixinas por técnica fenotípica e molecular, seguido de análise de carga de membrana. A fim da caracterização dos genes responsáveis pela resistência às polimixinas, o sequenciamento do genoma completo (WGS) foi realizado pela metodologia Illumina MiSeq. Foram identificados três isolados de K. variicola resistentes às polimixinas (M14, M15 e M50). Dois grupos clonais diferentes visualizados, sendo que M15 é um subclone de M14 e M50 um clone diferente. Análise de MLST demonstrou que M14 e M15 pertencem ao ST2362 e M50 ao ST3125. Testes de sensibilidade demonstraram que os três isolados são sensíveis a todos antimicrobianos testados, exceto às polimixinas. Não houve detecção de variantes do gene mcr nestes isolados. Análise de WSG demonstrou mutações com alteração de proteína em genes responsáveis por resistência às polimixinas em K. pneumoniae (mgrB, phoQ e pmrB). Estes mesmos genes apresentaram elevados níveis transcricionais observados na técnica de qRT-PCR demonstrando a relação dos mesmos e a resistência nos três isolados.