Investigação funcional do canal para potássio KIR2.6: novas perspectivas para o Gating do canal
Data
2021
Autores
Paninka, Rolf Matias 
Orientadores
Miranda Filho, Manoel de Arcisio
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The lipidic nature of the plasma membrane constitutes a barrier to the passage of electrically charged particles solvated in water. Ion channels are integral membrane proteins connecting the internal and external media of the cell allowing the passage of specific ions in a highly selective way. This work discusses a peculiar family of potassium channels called Kir, which stands for “Potassium inward rectifier”. Kir channels resemble a diode, allowing K+ to flow more easily into the cells, but limiting the flow in the reverse direction. Kir2.6 channel, encoded by the KCNJ18 gene, has been linked to a clinical condition called Thyrotoxic Periodic Paralysis (TPP). At the first part of the thesis, the direct DNA sequencing of two patients diagnosed with PPT, revealed two heterozygous mutations of the KCNJ18 gene: D252N and R386C, respectively. cDNAs of Kir2.6 wild-type (WT) channels and their mutants were transiently transfected to Embryonic Human Kidney cells (HEK293T) and analyzed by electrophysiology (voltage-clamp at whole-cell mode) and confocal laser scanning microscopy. D252N mutation showed a decrease in the current density of the channel in the order of 34%, when compared to the wild Kir2.6 (WT) channel. In addition, this mutation had a negative dominant effect when co-transfected in proportion of 50% with the Kir2.6 WT channel. Finally, D252N mutation demonstrated a substantial reduction (~ 51%) on membrane abundance of the channel compared to Kir2.6 WT channel. R386C mutation showed no significant change in comparation to Kir2.6 WT channel. At the second part of the thesis, the gating (the opening and closing mechanism) of the channel was investigated. For this purpose, two regions of the channel were selected so far not mentioned in the literature and, through a technique called alanine scanning, 20 amino acids of the channel-forming protein were systematically mutated by alanine. In doing so, we aim to study the individual contribution of each of these amino acids to the stability and functioning of the channel region located at the outer leaf of the plasma membrane.20 Using the same methodology used in the first part, nine amino acids were identified that proved to be critical for maintaining the conductive state of the channel: F102, W103, I105, A106, A158, V159, V162, and Q165. Six of them are in symmetrical positions in the first and second transmembrane segments of the channel-forming monomer: F102, I105, A106 are at the first segment and, A158, V159 and V162 are at the second segment. This suggests that these three pairs of amino acids may be important in maintaining the stability of the ion-conducting pore. In addition, the alignment of the total length of the protein between the Kir channel family (KCNJ1-KCNJ18) and the molecular analysis of distances between the amino acids at the pore region of the channel, showed possible interactions between amino acids F102 and F136, as well as between amino acids W103 and F130. The alanine mutation of the amino acids F130 and F136 revealed data consistent with this hypothesis, since the electrophysiological analysis showed total and partial suppression, respectively, of the channel activity. Our results suggest that these amino acids are important for maintaining the channel structure and the stability of the ion conducting pore and that there may be a mechanism for opening and closing the channel positioned in the most extracellular portion of the transmembrane domain of the channel.
A natureza lipídica da membrana plasmática constitui uma barreira à passagem de partículas eletricamente carregadas solvatadas em água. Canais iônicos são proteínas integrais de membrana que interligam os meios interno e externo da célula permitindo a passagem de íons específicos de maneira altamente seletiva. Neste trabalho é discutida uma família peculiar de canais para potássio denominada Kir, sigla em inglês para “Potassium inward rectifier”, i.e., canal para potássio de influxo retificado. O funcionamento dos canais Kir se assemelha a de um diodo, permitindo que o K+ flua mais facilmente para o interior das células, mas limitando o fluxo no sentido inverso. O canal Kir2.6, codificado pelo gene KCNJ18, vem sendo vinculado à um quadro cínico denominado Paralisia Periódica Tirotóxica (PPT). Na primeira parte da tese, o sequenciamento direto do DNA de dois pacientes diagnosticados com PPT, revelou duas mutações heterozigotas do gene KCNJ18: D252N e R386C, respectivamente. Os cDNAs dos canais Kir2.6, selvagem (WT) e seus mutantes, foram transfectados transitoriamente células embrionárias de rim humano, HEK293T, e analisados por eletrofisiologia (voltage-clamp, modo whole-cell) e microscopia confocal de varredura por laser. A mutação D252N apresentou uma diminuição na densidade de corrente do canal da ordem de 34%, quando comparado ao canal Kir2.6 selvagem (WT). Além disso, esta mutação apresentou efeito dominante negativo quando co-transfectada na proporção de 50% com o canal Kir2.6 WT. Por fim, a mutação D252N demonstrou uma redução substancial de ~51% na abundância de membrana do canal relativo ao canal Kir2.6 WT. A mutação R386C não apresentou mudança significativa em relação ao canal Kir2.6 WT. Na segunda parte da tese, foi investigado o mecanismo de abertura e fechamento (“gating”) do canal. Para tal, foram selecionadas duas regiões do canal até agora não citadas na literatura e, através de uma técnica denominada varredura por alaninas, 20 aminoácidos da proteína formadora do canal foram sistematicamente mutados por alanina. Com isso, objetivamos estudar a contribuição individual de cada18 um destes aminoácidos para a estabilidade e funcionamento da região do canal localizada no hemifolheto mais externo da membrana plasmática. Utilizando as mesmas metodologias da primeira parte, foram identificados nove aminoácidos que se mostraram críticos para manter o estado condutivo do canal: F102, W103, I105, A106, A158, V159, V162 e Q165. Em particular, seis deles se encontram em posições simétricas no primeiro e segundo segmentos transmembrana do monômero formador do canal: F102, I105, A106 no primeiro segmento e, A158, V159 e V162 no segundo segmento. Isto sugere que estes três pares de aminoácidos podem ser importantes para manter a estabilidade do poro condutor de íons. Além do mais, o alinhamento do comprimento total da proteína entre a família dos canais Kir (KCNJ1-KCNJ18) e a análise molecular de distância entre os aminoácidos da região do poro do canal, mostrou possíveis interações entre os aminoácidos F102 e F136, bem como entre aminoácidos W103 e F130. A mutação por alanina dos aminoácidos F130 e F136 revelou dados consistentes com essa hipótese, visto que a análise eletrofisiológica mostrou supressão total e parcial, respectivamente, da atividade do canal. Nossos resultados sugerem que os aminoácidos F102, I105, A106 no primeiro segmento transmembrana e A158, V159 e V162 F102, I105, A106 no segundo segmento, bem como F130 e F136 situados na hélice reentrante que antecede o filtro de seletividade do canal, são importantes para manter a estrutura do canal e a estabilidade do poro condutor de íons e que pode haver um mecanismo de abertura e fechamento do canal posicionado na porção mais extracelular do domínio transmembrana do canal.
A natureza lipídica da membrana plasmática constitui uma barreira à passagem de partículas eletricamente carregadas solvatadas em água. Canais iônicos são proteínas integrais de membrana que interligam os meios interno e externo da célula permitindo a passagem de íons específicos de maneira altamente seletiva. Neste trabalho é discutida uma família peculiar de canais para potássio denominada Kir, sigla em inglês para “Potassium inward rectifier”, i.e., canal para potássio de influxo retificado. O funcionamento dos canais Kir se assemelha a de um diodo, permitindo que o K+ flua mais facilmente para o interior das células, mas limitando o fluxo no sentido inverso. O canal Kir2.6, codificado pelo gene KCNJ18, vem sendo vinculado à um quadro cínico denominado Paralisia Periódica Tirotóxica (PPT). Na primeira parte da tese, o sequenciamento direto do DNA de dois pacientes diagnosticados com PPT, revelou duas mutações heterozigotas do gene KCNJ18: D252N e R386C, respectivamente. Os cDNAs dos canais Kir2.6, selvagem (WT) e seus mutantes, foram transfectados transitoriamente células embrionárias de rim humano, HEK293T, e analisados por eletrofisiologia (voltage-clamp, modo whole-cell) e microscopia confocal de varredura por laser. A mutação D252N apresentou uma diminuição na densidade de corrente do canal da ordem de 34%, quando comparado ao canal Kir2.6 selvagem (WT). Além disso, esta mutação apresentou efeito dominante negativo quando co-transfectada na proporção de 50% com o canal Kir2.6 WT. Por fim, a mutação D252N demonstrou uma redução substancial de ~51% na abundância de membrana do canal relativo ao canal Kir2.6 WT. A mutação R386C não apresentou mudança significativa em relação ao canal Kir2.6 WT. Na segunda parte da tese, foi investigado o mecanismo de abertura e fechamento (“gating”) do canal. Para tal, foram selecionadas duas regiões do canal até agora não citadas na literatura e, através de uma técnica denominada varredura por alaninas, 20 aminoácidos da proteína formadora do canal foram sistematicamente mutados por alanina. Com isso, objetivamos estudar a contribuição individual de cada18 um destes aminoácidos para a estabilidade e funcionamento da região do canal localizada no hemifolheto mais externo da membrana plasmática. Utilizando as mesmas metodologias da primeira parte, foram identificados nove aminoácidos que se mostraram críticos para manter o estado condutivo do canal: F102, W103, I105, A106, A158, V159, V162 e Q165. Em particular, seis deles se encontram em posições simétricas no primeiro e segundo segmentos transmembrana do monômero formador do canal: F102, I105, A106 no primeiro segmento e, A158, V159 e V162 no segundo segmento. Isto sugere que estes três pares de aminoácidos podem ser importantes para manter a estabilidade do poro condutor de íons. Além do mais, o alinhamento do comprimento total da proteína entre a família dos canais Kir (KCNJ1-KCNJ18) e a análise molecular de distância entre os aminoácidos da região do poro do canal, mostrou possíveis interações entre os aminoácidos F102 e F136, bem como entre aminoácidos W103 e F130. A mutação por alanina dos aminoácidos F130 e F136 revelou dados consistentes com essa hipótese, visto que a análise eletrofisiológica mostrou supressão total e parcial, respectivamente, da atividade do canal. Nossos resultados sugerem que os aminoácidos F102, I105, A106 no primeiro segmento transmembrana e A158, V159 e V162 F102, I105, A106 no segundo segmento, bem como F130 e F136 situados na hélice reentrante que antecede o filtro de seletividade do canal, são importantes para manter a estrutura do canal e a estabilidade do poro condutor de íons e que pode haver um mecanismo de abertura e fechamento do canal posicionado na porção mais extracelular do domínio transmembrana do canal.