Além da atividade proteolítica das metaloproteases: atividade imunomoduladora da Thimet oligopeptidase (TOP) no tratamento do melanoma murino B16F10Nex2
Data
2017-02-28
Autores
De Amat Herbozo, Carolina Cecilia 
Orientadores
Rodrigues, Elaine Guadelupe
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Previous studies in our laboratory have shown that two bacterial metalloproteases, oligopeptidase A (OpdA) and arazyme, have antitumor activity. This property was independent of their proteolytic activity, and it was mediated by an immunomodulatory effect, involving the activation of antigen presenting cells (APCs). Those results could indicate that OpdA and arazyme were recognized by APCs because of their bacterial origin or otherwise, the immunomodulatory ability was a characteristic of metalloproteases in general, regardless of their origin. The aim of the present study was to evaluate the immunomodulatory and antitumor activity of thimet oligopeptidase (TOP), a murine metallopeptidase, in the B16F10-Nex2 murine melanoma model. Expression and purification of the recombinant version of TOP (rTOP) were optimized, and active and heat-inactivated forms were analyzed. rTOP did not show direct cytotoxic activity in vitro on tumor cells. In vivo assays showed that rTOP has a dose-dependent antitumor activity only in the metastatic, but not in the subcutaneous model. The antitumor effect was independent of the rTOP proteolytic activity, and dependent on a functional adaptive immune response, since it was abolished in immunodeficient animals. Cytokine analysis of serum samples and ex vivo restimulated spleen and lymph node cells revealed that a tumor-specific Th1 response was favored in rTOP treated animals. The active form of the metalloprotease stimulated an increase of IFN-γ, whereas the heat-inactivated form inhibited IL-10 production. Murine bone marrow-derived macrophages and dendritic cells (BMDMs and BMDCs, respectively), were activated in the presence of both active and inactive rTOP, resulting in increased NO production, IL-12p40, TNF-α and IL-10 secretion, and expression of the costimulatory molecules CD80, CD86 and CD40 in BMDCs. Assays in the presence of polymyxin B and with proteinase K-degraded metaloprotease demonstrated that the immunomodulatory activity of rTOP on APCs is not due to the residual LPS of the recombinant preparation. Assays with cells obtained from knockout mice or using specific antagonists/inhibitors determined that the activation of BMDCs is dependent on the presence and function of the TLR4 receptor and the MyD88 and TRIF adapters, and participation of the JNK, p38 and MAP/ERK kinases. In addition, the MyD88 pathway was essential for the antitumor effect of rTOP in the metastatic melanoma model in vivo. In conclusion, rTOP exhibits antitumor activity in the murine metastatic melanoma model mediated by an immunomodulatory effect, and the activation of APCs by rTOP requires the same receptor and signaling pathways as the bacterial metalloproteases studied before.
Estudos prévios realizados em nosso laboratório, revelaram que as metaloproteases bacterianas oligopeptidase A (OpdA) e arazima têm atividade antitumoral, independente da atividade proteolítica e mediado por um efeito imunomodulador capaz de ativar células apresentadoras de antígeno (APCs). Os resultados indicaram que a OpdA e a arazima poderiam ser reconhecidas pelas APCs devido a sua origem bacteriana, ou alternativamente que as propriedades descritas seriam características das metaloproteases em geral, independentemente da sua origem. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade imunomoduladora e antitumoral da thimet oligopeptidase (TOP), uma metalopeptidase murina, no modelo de melanoma murino B16F10-Nex2. A expressão e purificação da versão recombinante da TOP (rTOP) foi otimizada, e a forma inativa da enzima foi obtida por aquecimento. A rTOP não apresentou atividade citotóxica direta sobre as células de melanoma murino B16F10-Nex2 in vitro. Ensaios in vivo mostraram que a rTOP apresentou atividade antitumoral dose-dependente apenas no modelo metastático mas não no subcutâneo. O efeito foi independente da atividade proteolítica da enzima e dependente de uma resposta imune adaptativa funcional, pois foi abolida em animais imunodeficientes. A análise de citocinas no soro e nas culturas de células de baço e linfonodo reestimuladas ex vivo revelou um favorecimento da resposta Th1 tumor-específica nos animais tratados com rTOP. A forma ativa da metaloprotease estimulou um aumento de IFN-γ, enquanto que a forma inativa induziu uma inibição da produção de IL-10. Macrófagos e células dendríticas murinas derivados de progenitores de medula óssea (BMDM e BMDCs, respectivamente) foram ativados em presença de rTOP tanto ativa quanto inativa, resultando em um incremento da produção de NO, na secreção de citocinas IL-12p40, TNF-α e IL-10, e na expressão das moléculas coestimuladoras CD80, CD86 e CD40 na superfície das BMDCs. Ensaios em presença de polimixina B e após degradação com proteinase K demostraram que a atividade imunomoduladora da rTOP sobre as APCs não é devido ao LPS residual da preparação recombinante. Ensaios com células obtidas de camundongos geneticamente deletados, ou utilizando antagonistas e inibidores específicos, determinaram que a ativação de BMDCs é dependente da presença e função do receptor TLR4 e dos adaptadores MyD88 e TRIF, com participação das quinases JNK, p38 e MAP/ERK. Além disso, a via MyD88 foi essencial para o efeito antitumoral da rTOP no modelo de melanoma metastático in vivo. Em conclusão, a rTOP apresenta atividade antitumoral no modelo de melanoma metastático murino mediada por um efeito imunomodulador, e a ativação de APCs pela rTOP requer o mesmo receptor e vias de sinalização que as metaloproteases bacterianas estudadas anteriormente.
Estudos prévios realizados em nosso laboratório, revelaram que as metaloproteases bacterianas oligopeptidase A (OpdA) e arazima têm atividade antitumoral, independente da atividade proteolítica e mediado por um efeito imunomodulador capaz de ativar células apresentadoras de antígeno (APCs). Os resultados indicaram que a OpdA e a arazima poderiam ser reconhecidas pelas APCs devido a sua origem bacteriana, ou alternativamente que as propriedades descritas seriam características das metaloproteases em geral, independentemente da sua origem. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade imunomoduladora e antitumoral da thimet oligopeptidase (TOP), uma metalopeptidase murina, no modelo de melanoma murino B16F10-Nex2. A expressão e purificação da versão recombinante da TOP (rTOP) foi otimizada, e a forma inativa da enzima foi obtida por aquecimento. A rTOP não apresentou atividade citotóxica direta sobre as células de melanoma murino B16F10-Nex2 in vitro. Ensaios in vivo mostraram que a rTOP apresentou atividade antitumoral dose-dependente apenas no modelo metastático mas não no subcutâneo. O efeito foi independente da atividade proteolítica da enzima e dependente de uma resposta imune adaptativa funcional, pois foi abolida em animais imunodeficientes. A análise de citocinas no soro e nas culturas de células de baço e linfonodo reestimuladas ex vivo revelou um favorecimento da resposta Th1 tumor-específica nos animais tratados com rTOP. A forma ativa da metaloprotease estimulou um aumento de IFN-γ, enquanto que a forma inativa induziu uma inibição da produção de IL-10. Macrófagos e células dendríticas murinas derivados de progenitores de medula óssea (BMDM e BMDCs, respectivamente) foram ativados em presença de rTOP tanto ativa quanto inativa, resultando em um incremento da produção de NO, na secreção de citocinas IL-12p40, TNF-α e IL-10, e na expressão das moléculas coestimuladoras CD80, CD86 e CD40 na superfície das BMDCs. Ensaios em presença de polimixina B e após degradação com proteinase K demostraram que a atividade imunomoduladora da rTOP sobre as APCs não é devido ao LPS residual da preparação recombinante. Ensaios com células obtidas de camundongos geneticamente deletados, ou utilizando antagonistas e inibidores específicos, determinaram que a ativação de BMDCs é dependente da presença e função do receptor TLR4 e dos adaptadores MyD88 e TRIF, com participação das quinases JNK, p38 e MAP/ERK. Além disso, a via MyD88 foi essencial para o efeito antitumoral da rTOP no modelo de melanoma metastático in vivo. Em conclusão, a rTOP apresenta atividade antitumoral no modelo de melanoma metastático murino mediada por um efeito imunomodulador, e a ativação de APCs pela rTOP requer o mesmo receptor e vias de sinalização que as metaloproteases bacterianas estudadas anteriormente.