Vias de sinalização intracelular envolvidas no efeito proliferativo de relaxina em células de sertoli
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Data
2011-03-30
Autores
Nascimento, Aline Rosa 
Orientadores
Lazari, Maria de Fatima Magalhaes
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Relaxin is an insulin-related peptide that activates the G-protein coupled receptor RXFP1. Although relaxin plays an important role in female reproduction its physiological role in the male reproductive system is still unclear. We have previously demonstrated that relaxin and RXFP1 are expressed in testis (FILONZI et al., 2007; CARDOSO et al., 2010). Both relaxin and RXFP1 have been immunolocalized to Sertoli and germ cells, suggesting that relaxin may be important for spermatogenesis. In fact, relaxin induced proliferation of Sertoli cells in culture. G-protein coupled receptors may activate cell proliferation by several mechanisms: transactivation of tyrosine kinase receptors and/ or activation of intracellular signaling kinases that culminates in the activation of MAP Kinase (ERK1/2) or PI3K pathway. The aim of the present study was to investigate the signaling events that lead to the proliferative response of relaxin in rat Sertoli cells. Primary culture of Sertoli cells was obtained from 15-day old Wistar rats. Cells were incubated in the absence or presence of increasing concentrations of relaxin (25-200 ng/ml), for different periods (5, 10, and 30 min), at 35°C. To characterize upstream pathways to ERK1/2 phosphorylation, cells were previously treated with the inhibitor of MEK1/2, U0126 (20 ìM for 30 minutes; N=3); the inhibitor of the kinase activity of the EGF receptor (EGFR) AG 1478 (1 ìM for 15 minutes; N=4); the inhibitor of Src family of tyrosine kinases, PP2 (5 nM for 30 minutes; N=4); the inhibitor of metalloproteases, GM 6001 (200 nM for 30 minutes; N=4); the PI3K inhibitor, wortmannin (100 nM for 30 minutes; N=5); the inhibitor of PKA, H89 (2 ìM for 2 hours; N=5); the general PKC inhibitor, GF 109203X (5 ìM for 30 minutes; N= 3) or the inhibitor of Gi/o, pertussis toxin (PTX, 100 ng/ml for 16 h; N=2). ERK1/2 phosphorylation was determined by Western Blot analysis. Relaxin increased ERK1/2 phosphorylation in a time and concentration-dependent fashion. The peak of ERK1/2 phosphorylation occurred at 5 minutes, and with 50 ng/ml of relaxin (N=3). ERK1/2 phosphorylation induced by relaxin was inhibited by pre-treatment with AG 1478, PP2, wortmannin, GF 109203X and pertussis toxin, but not with H89 and GM 6001. The effect of relaxin on Sertoli cell proliferation was determined by incubation of the cells with 50 ng/ml relaxin, for 24 hours, and by determination of the methyl [3H] thymidine incorporation, in the absence or presence of key inhibitors of the ERK1/2 pathway. Celll proliferation mediated by ERK1/2 was inhibited by the MEK1/2 inhibitor, UO126, and by the PI3K inhibitor, wortmannin. Other inhibitors of the ERK1/2 pathway such as the PKC inhibitor GF 109203X and the inhibitor of the tyrosine kinase of EGFR, AG1478, were not effective. Our results suggest that relaxin stimulates ERK1/2 phosphorylation and PI3K pathways, and that PI3K plays a central role in relaxin mitogenic effect in Sertoli cells. We propose the following sequence of events for the stimulatory role of relaxin in Sertoli cell proliferation: coupling of the stimulated RXFP1 with a Gi protein, release of âã subunits and activation of PI3K, which in turn can phosphorytale and activate PKC, Src and Ras. All these pathways can lead to Raf/MEK/ERK activation, and Src can phosphorylate EGFR, which may also contribute to ERK1/2 activation. ERK1/2 may regulate transcription of genes related to cell cycle regulation. Alternatively, PI3K may also activate transcription of genes that regulate the cell cycle. Further studies are necessary to clarify the mechanisms involved in the cell cycle regulation and cell proliferation induced by relaxin. This event certainly plays a central role in spermatogenesis and male (in)fertility and relaxin emerges as a novel paracrine/autocrine hormone that regulates Sertoli cell function.
Relaxina e um peptideo relacionado a insulina que ativa o receptor acoplado a proteina G RXFP1. Apesar da relaxina desempenhar funcoes importantes no sistema reprodutor feminino, seu papel fisiologico no sistema reprodutor masculino e ainda incerto. Demonstramos previamente que relaxina e RXFP1 estao expressos em testiculos (FILONZI et al., 2007; CARDOSO et al., 2010). Relaxina e RXFP1 estao imunolocalizados em celulas de Sertoli e celulas germinativas, sugerindo que relaxina pode ser importante para a espermatogenese. De fato, relaxina induziu a proliferacao de celulas de Sertoli em cultura. Receptores acoplados a proteina G podem ativar a proliferacao celular por diversos mecanismos: transativacao de receptores tirosina quinase e/ou ativacao de quinases da sinalizacao intracelular que culminam na ativacao das vias da MAP quinase (ERK1/2) ou PI3K. O objetivo do presente estudo foi investigar as vias de sinalizacao que levam a resposta proliferativa de relaxina em celulas de Sertoli de ratos. Cultura primaria de celulas de Sertoli foi obtida de ratos Wistar de 15 dias de idade. As celulas foram incubadas na ausencia ou na presenca de concentracoes crescentes de relaxina (25-200 ng/ml), por diferentes periodos (5, 10 e 30 minutos), a 35 ‹C. Para caracterizar vias sinalizadoras que antecedem a fosforilacao de ERK1/2, as celulas foram previamente tratadas com o inibidor de MEK1/2, U0126 (20 ƒÊM por 30 minutos; N=3); o inibidor da atividade quinase do receptor de EGF (EGFR), AG 1478 (1 ƒÊM por 15 minutos; N=4); o inibidor da familia de Scr tirosina quinases, PP2 (5 nM por 30 minutos; N=4); o inibidor de metaloproteases, GM 6001 (200 nM por 30 minutos; N=4); o inibidor de PI3K, wortmannin (100 nM por 30 minutos; N=5); o inibidor de PKA, H89 (2 ƒÊM por 2 horas; N=5); o inibidor geral PKC, GF 109203X (5 ƒÊM por 30 minutos; N= 3) ou o inibidor de Gi/o, toxina pertussis (PTX, 100 ng/ml por 16 h; N=2). Fosforilacao de ERK1/2 foi determinada por analises de Western Blot. Relaxina aumentou a fosforilacao de ERK1/2 de modo dependente do tempo e da concentracao. O pico de fosforilacao de ERK1/2 ocorreu aos 5 minutos e com 50 ng/ml de relaxina (N=3). Fosforilacao de ERK1/2 induzida por relaxina foi inibida pelo pre-tratamento com AG 1478, PP2, wortmannin, GF 109203X e toxina pertussis, mas nao com H89 e GM 6001. O efeito da relaxina na proliferacao celular foi determinado pela incubacao das celulas com 50 ng/ml de relaxina, por 24 horas, e pela determinacao da incorporacao de [3H] timidina, na ausencia ou na presenca dos inibidores importantes da via ERK1/2, determinados na etapa anterior. A proliferacao celular mediada por ERK1/2 foi inibida pelo inibidor de MEK1/2, U0126, confirmando o envolvimento de ERK1/2 no efeito proliferativo darelaxina em celulas de Sertoli e pelo inibidor de PI3K, wortmannin. Outros inibidores da via da ERK1/2, como o inibidor de PKC, GF 109203X e o inibidor da tirosina quinase do EGFR, AG 1478, nao foram efetivos. Nossos resultados sugerem que relaxina estimula fosforilacao de ERK1/2 e a via da PI3K, e que PI3K tem um papel central no efeito mitogenico da relaxina em celulas de Sertoli. Os resultados obtidos nos levam a propor o seguinte esquema de eventos para explicar o mecanismo envolvido na proliferacao de celulas de Sertoli induzida por relaxina: RXFP1 ativado se acopla a proteina Gi, liberando as subunidades ƒÀƒÁ que ativam a PI3K, que, por sua vez, pode fosforilar e ativar PKC, Scr e Ras. Todas essas vias podem levar a ativacao de Raf/MEK/ERK; alem disso, Scr pode fosforilar o EGRF, que tambem contribui para ativacao de ERK1/2. ERK1/2 pode regular a transcricao de genes que regulam o ciclo celular. Altenativamente, PI3K tambem pode diretamente estar envolvida na regulacao da transcricao de genes que regulam o ciclo celular. Mais estudos sao necessarios para esclarecer os mecanismos envolvidos na regulacao do ciclo celular e na proliferacao celular induzida por relaxina. Este evento certamente desempenha um papel central na espermatogenese e fertilidade masculina e relaxina emerge como um novo fator paracrino/autocrino que regula a funcao das celula de Sertoli.
Relaxina e um peptideo relacionado a insulina que ativa o receptor acoplado a proteina G RXFP1. Apesar da relaxina desempenhar funcoes importantes no sistema reprodutor feminino, seu papel fisiologico no sistema reprodutor masculino e ainda incerto. Demonstramos previamente que relaxina e RXFP1 estao expressos em testiculos (FILONZI et al., 2007; CARDOSO et al., 2010). Relaxina e RXFP1 estao imunolocalizados em celulas de Sertoli e celulas germinativas, sugerindo que relaxina pode ser importante para a espermatogenese. De fato, relaxina induziu a proliferacao de celulas de Sertoli em cultura. Receptores acoplados a proteina G podem ativar a proliferacao celular por diversos mecanismos: transativacao de receptores tirosina quinase e/ou ativacao de quinases da sinalizacao intracelular que culminam na ativacao das vias da MAP quinase (ERK1/2) ou PI3K. O objetivo do presente estudo foi investigar as vias de sinalizacao que levam a resposta proliferativa de relaxina em celulas de Sertoli de ratos. Cultura primaria de celulas de Sertoli foi obtida de ratos Wistar de 15 dias de idade. As celulas foram incubadas na ausencia ou na presenca de concentracoes crescentes de relaxina (25-200 ng/ml), por diferentes periodos (5, 10 e 30 minutos), a 35 ‹C. Para caracterizar vias sinalizadoras que antecedem a fosforilacao de ERK1/2, as celulas foram previamente tratadas com o inibidor de MEK1/2, U0126 (20 ƒÊM por 30 minutos; N=3); o inibidor da atividade quinase do receptor de EGF (EGFR), AG 1478 (1 ƒÊM por 15 minutos; N=4); o inibidor da familia de Scr tirosina quinases, PP2 (5 nM por 30 minutos; N=4); o inibidor de metaloproteases, GM 6001 (200 nM por 30 minutos; N=4); o inibidor de PI3K, wortmannin (100 nM por 30 minutos; N=5); o inibidor de PKA, H89 (2 ƒÊM por 2 horas; N=5); o inibidor geral PKC, GF 109203X (5 ƒÊM por 30 minutos; N= 3) ou o inibidor de Gi/o, toxina pertussis (PTX, 100 ng/ml por 16 h; N=2). Fosforilacao de ERK1/2 foi determinada por analises de Western Blot. Relaxina aumentou a fosforilacao de ERK1/2 de modo dependente do tempo e da concentracao. O pico de fosforilacao de ERK1/2 ocorreu aos 5 minutos e com 50 ng/ml de relaxina (N=3). Fosforilacao de ERK1/2 induzida por relaxina foi inibida pelo pre-tratamento com AG 1478, PP2, wortmannin, GF 109203X e toxina pertussis, mas nao com H89 e GM 6001. O efeito da relaxina na proliferacao celular foi determinado pela incubacao das celulas com 50 ng/ml de relaxina, por 24 horas, e pela determinacao da incorporacao de [3H] timidina, na ausencia ou na presenca dos inibidores importantes da via ERK1/2, determinados na etapa anterior. A proliferacao celular mediada por ERK1/2 foi inibida pelo inibidor de MEK1/2, U0126, confirmando o envolvimento de ERK1/2 no efeito proliferativo darelaxina em celulas de Sertoli e pelo inibidor de PI3K, wortmannin. Outros inibidores da via da ERK1/2, como o inibidor de PKC, GF 109203X e o inibidor da tirosina quinase do EGFR, AG 1478, nao foram efetivos. Nossos resultados sugerem que relaxina estimula fosforilacao de ERK1/2 e a via da PI3K, e que PI3K tem um papel central no efeito mitogenico da relaxina em celulas de Sertoli. Os resultados obtidos nos levam a propor o seguinte esquema de eventos para explicar o mecanismo envolvido na proliferacao de celulas de Sertoli induzida por relaxina: RXFP1 ativado se acopla a proteina Gi, liberando as subunidades ƒÀƒÁ que ativam a PI3K, que, por sua vez, pode fosforilar e ativar PKC, Scr e Ras. Todas essas vias podem levar a ativacao de Raf/MEK/ERK; alem disso, Scr pode fosforilar o EGRF, que tambem contribui para ativacao de ERK1/2. ERK1/2 pode regular a transcricao de genes que regulam o ciclo celular. Altenativamente, PI3K tambem pode diretamente estar envolvida na regulacao da transcricao de genes que regulam o ciclo celular. Mais estudos sao necessarios para esclarecer os mecanismos envolvidos na regulacao do ciclo celular e na proliferacao celular induzida por relaxina. Este evento certamente desempenha um papel central na espermatogenese e fertilidade masculina e relaxina emerge como um novo fator paracrino/autocrino que regula a funcao das celula de Sertoli.
Descrição
Citação
NASCIMENTO, Aline Rosa do. Vias de sinalização intracelular envolvidas no efeito proliferativo de relaxina em células de sertoli. 2011. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2011.