Estudo da autofagia mediada por TFEB: desvendando um papel para os receptores Two-Pore Channels
Data
2020-12-18
Autores
Guarache, Gabriel Cicolin 
Orientadores
Pereira, Gustavo Jose Da Silva
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Autophagy is a lysosomal catabolic process that degrades and recycles intracellular components in response to cellular stress. One of important regulator of this process is the transcription factor EB (TFEB), which is translocated to the nucleus through the lysosomal Ca2+ release and further activates the transcription machinery related to lysosomal biogenesis and autophagy genes. Recent studies have demonstrated that the Ca2+ signals from the endolysosomal system mediated by the newly second messenger NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate) via Two-Pore Channels (TPCs) activation induces autophagy. Since TFEB activation and consequent autophagy induction by TPCs signaling are dependent on lysosomal Ca2+, this present study investigated the possible participation of the TFEB on TPCs-mediated autophagy in HeLa cell line. For this purpose, firstly, was verified that autophagy was induced by NAADP-AM [100 nM], a membrane permeant analog of NAADP, accompanied by decrease in TFEB cytosolic levels during 4 hours. In HeLaGFP-TFEB cells, NAADP-AM [100 nM] for 1 hour induced TFEB nuclear translocation, whereas Ned-19 [10 μM], a NAADP non-competitive antagonist, inhibited autophagy, increased TFEB cytosolic levels and decreased nuclear/cytosolic TFEB ratio. To evaluate the possible participation of TPCs on TFEB translocation, cells overexpressing Myc-TPC1 or Myc-TPC2 were treated with NAADP-AM [100 nM] for 1 hour. As result, TPC1-overexpressing cells treated with NAADP-AM [100 nM] as well as the TPC2-overexpressing cells were able to translocate TFEB to the nucleus. Furthermore, TFEB translocation induced by starvation was potentiated by TPCs overexpression, especially in TPC2-overexpressing cells. Taken together, these results indicated that TFEB subcellular localization can be modulated by Ca2+/TPCs cell signaling in response to NAADP and starvation. The comprehension of the underlying mechanisms associated to TFEB-mediated autophagy is important for potential therapeutic targets in several diseases.
A autofagia é um processo catabólico lisossomal que visa a degradação e reciclagem de componentes intracelulares. Um dos principais reguladores desse processo é o fator de transcrição EB (TFEB), que se transloca para o núcleo mediante liberação de Ca2+ lisossomal e ativa genes relacionados com biogênese lisossomal e autofagia. Recentes estudos demonstraram que a sinalização de Ca2+ mediada pelo segundo mensageiro NAADP (ácido nicotínico adenina dinucleotídeo fosfato) por meio de receptores Two-Pore Channels (TPCs) induziu a autofagia de modo dependente da liberação de Ca2+ a partir do sistema endolisossomal. Visto que a ativação do TFEB e a indução da autofagia são dependentes da sinalização de Ca2+, este presente projeto investigou se o TFEB participaria da via de sinalização dos TPCs na regulação da autofagia. Primeiramente, foi verificado que a autofagia foi induzida pelo tratamento de células HeLa com NAADP-AM, análogo do NAADP permeante de membranas, na concentração de [100 nM] por 2 horas e que a mesma concentração diminuiu os níveis de TFEB citosólico em até 4 horas. Em células HeLaGFP-TFEB, o NAADP-AM [100 nM] por 1 hora induziu a translocação do TFEB para o núcleo, sendo que o Ned-19 [10 μM], antagonista não competitivo do NAADP, inibiu a autofagia, aumentou os níveis de TFEB citosólico e diminuiu a razão TFEB nuclear/TFEB citosólico. Para investigar a participação dos TPCs na translocação do TFEB, células superexpressando Myc-TPC1 ou Myc-TPC2 foram tratadas com NAADP-AM [100 nM] por 1 hora. Como resultado, as células superexpressando TPC1 na presença do tratamento com NAADP-AM [100 nM], e a superexpressão do TPC2 causaram uma translocação do TFEB para o núcleo. Adicionalmente, a translocação do TFEB mediada por starvation foi potencializada com a superexpressão dos TPCs, sendo maior para o TPC2. Os resultados deste trabalho indicaram que a localização subcelular do TFEB pode ser modulada pela sinalização dos receptores TPCs em resposta ao NAADP e ao starvation. A compreensão da presente sinalização celular é importante para o estudo de novos alvos farmacológicos, no entanto, novos estudos para a compreensão dos mecanismos subjacentes serão necessários.
A autofagia é um processo catabólico lisossomal que visa a degradação e reciclagem de componentes intracelulares. Um dos principais reguladores desse processo é o fator de transcrição EB (TFEB), que se transloca para o núcleo mediante liberação de Ca2+ lisossomal e ativa genes relacionados com biogênese lisossomal e autofagia. Recentes estudos demonstraram que a sinalização de Ca2+ mediada pelo segundo mensageiro NAADP (ácido nicotínico adenina dinucleotídeo fosfato) por meio de receptores Two-Pore Channels (TPCs) induziu a autofagia de modo dependente da liberação de Ca2+ a partir do sistema endolisossomal. Visto que a ativação do TFEB e a indução da autofagia são dependentes da sinalização de Ca2+, este presente projeto investigou se o TFEB participaria da via de sinalização dos TPCs na regulação da autofagia. Primeiramente, foi verificado que a autofagia foi induzida pelo tratamento de células HeLa com NAADP-AM, análogo do NAADP permeante de membranas, na concentração de [100 nM] por 2 horas e que a mesma concentração diminuiu os níveis de TFEB citosólico em até 4 horas. Em células HeLaGFP-TFEB, o NAADP-AM [100 nM] por 1 hora induziu a translocação do TFEB para o núcleo, sendo que o Ned-19 [10 μM], antagonista não competitivo do NAADP, inibiu a autofagia, aumentou os níveis de TFEB citosólico e diminuiu a razão TFEB nuclear/TFEB citosólico. Para investigar a participação dos TPCs na translocação do TFEB, células superexpressando Myc-TPC1 ou Myc-TPC2 foram tratadas com NAADP-AM [100 nM] por 1 hora. Como resultado, as células superexpressando TPC1 na presença do tratamento com NAADP-AM [100 nM], e a superexpressão do TPC2 causaram uma translocação do TFEB para o núcleo. Adicionalmente, a translocação do TFEB mediada por starvation foi potencializada com a superexpressão dos TPCs, sendo maior para o TPC2. Os resultados deste trabalho indicaram que a localização subcelular do TFEB pode ser modulada pela sinalização dos receptores TPCs em resposta ao NAADP e ao starvation. A compreensão da presente sinalização celular é importante para o estudo de novos alvos farmacológicos, no entanto, novos estudos para a compreensão dos mecanismos subjacentes serão necessários.