Caracterização funcional de um composto capaz de regular o desenvolvimento celular de Trypanosoma cruzi
Data
2019-03-28
Autores
Araujo Junior, Adalberto Miguel De 
Orientadores
Freitas Junior, Lucio Holanda Gondim De
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Chagas disease, caused by the kinetoplastid parasite Trypanosoma cruzi, remains one of the most neglected tropical illnesses in the world. Approximately 6 to 7 million people worldwide are estimated to be infected with T. cruzi. Benznidazole (BNZ) and nifurtimox (NFX), the only drugs available to treat the disease, are associated with severe side effects and unclear efficacy on the chronic phase of infection. The pathogenesis related to such disease is still poorly understood, which reinforces the importance of researching more about the basic biology of T. cruzi infection, replication and differentiation, once only this way new strategies of chemotherapies will be discovered. In the absence of clinically validated molecular drug targets, development of novel phenotypic screening assays may result in the discovery of compounds that can inducephenotypes related to distinct mechanisms of action not investigated so far. In this report, we attempted to discuss how relevant the phenotypic screening approach can be for the understanding of T. cruzi cell biology. From the high content screening of a library of 4,000 putative kinase inhibitors, we selected some compounds of interest, which showed low cytotoxicity and capacity to induce specific phenotypes of interference in the normal intracellular development of the parasite. One of such compounds (named HF) inhibited the parasite replication without causing loss of cell viability. The functional characterization of the HF activity showed that: (i) the phenotype of intracellular development arrest was not restricted to a host cell type; (ii) the compound was able to inhibit the replication of different T. cruzi strains (Y, Sylvio X10/1 e CL Brener strain); (iii) the phenotype of arrest was reversible upon compound removal, once the parasite from that point grows normally concluding its intracellular cycle by differentiation to trypomastigotes; (iv) the compound did not show cytotoxicity for distinct host cells (U2OS, LLC-MK2, NRK-52E and BHK-51) for up to the maximum concentration of 100 µM for 48 h, being highly selective for the parasite; (v) the molecule also was able to induce arrest in the epimastigote form of T. cruzi without causing loss of viability up to 96 h, but displayed a dose-dependent cidal activity against bloodstream forms of Trypanosoma brucei and promastigote forms of Leishmania donovani; and (vi) the compound caused T. cruzi cell cycle arrest, being the most of the cell population at G1, unlike what was observed in cells treated with benznidazole. Altogether, these results suggest that this compound acts via a regulator of cell cycle that can specifically cause arrest in T. cruzi and not in mammalian cells. Regarding the other trypanosomatids, there may be a regulation of the cell cycle by the compound, however we did not observe the same phenotypic action as seen in T. cruzi. Moreover, this work has shown us the potential of HF to be applied as a chemical probe in investigations regarding T. cruzi replication and development.
A doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi da classe Kinetoplastida, continua sendo uma das doenças tropicais mais negligenciadas do mundo. Estima-se que cerca de 6 a 7 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas pelo T. cruzi. O benznidazole (BNZ) e o nifurtimox (NFX), os únicos fármacos disponíveis para o tratamento da doença, estão associados a severos efeitos adversos e a uma eficácia pouco clara na fase crônica da infecção. A patogênese relacionada a essa doença ainda é pouco compreendida, o que reforça a importância de se pesquisar mais sobre a biologia básica da infecção, replicação e diferenciação de T. cruzi, pois somente dessa maneira novas estratégias de quimioterapia serão descobertas. Na ausência de alvos farmacológicos clinicamente validados, o desenvolvimento de novos ensaios de triagem fenotípica pode resultar na descoberta de compostos que possam induzir fenótipos relacionados a mecanismos distintos de ação até então não investigados. Neste trabalho, procuramos discutir a relevância da abordagem da triagem fenotípica para o entendimento da biologia celular do T. cruzi. A partir da triagem de alto conteúdo de uma biblioteca de 4 mil inibidores putativos de quinases, foram selecionados alguns compostos de interesse, os quais apresentaram baixa citotoxicidade e capacidade de induzir fenótipos específicos de interferência no desenvolvimento intracelular normal do parasita. Um desses compostos (denominado HF) inibiu a replicação do parasita sem causar perda de viabilidade celular. A caracterização funcional da atividade de HF mostrou que: (i) o fenótipo de parada do desenvolvimento intracelular não se restringiu a um tipo de célula hospedeira; (ii) o composto foi capaz de inibir a replicação de diferentes cepas de T. cruzi (Y, Sylvio X10/1 e CL Brener); (iii) o fenótipo de inibição da replicação parasitária foi reversível após a remoção do composto, uma vez que o parasita a partir desse ponto cresce normalmente e conclui seu ciclo intracelular por diferenciação para tripomastigotas; (iv) o composto não apresentou citotoxicidade para células hospedeiras distintas (U2OS, LLC-MK2, NRK-52E e BHK51) até a concentração máxima de 100 µM por 48 h, sendo altamente seletivo para o parasita; (v) a molécula também foi capaz de inibir a replicação da forma epimastigota de T. cruzi sem causar perda de viabilidade até 96 h, todavia apresentou atividade citocida concentração-dependente contra a forma sanguínea de Trypanosoma brucei e a forma promastigota de Leishmania donovani; e (vi) o composto causou um tipo de parada no ciclo celular de T. cruzi, fazendo com que a maioria da população celular permanecesse na fase G1 do ciclo, diferentemente do que foi observado em células tratadas com benznidazole. Em conjunto, os resultados que obtivemos sugerem que este composto age através de um regulador do ciclo celular que pode especificamente bloquear o ciclo celular em T. cruzi e não em células de mamíferos. Em relação aos outros tripanossomatídeos, pode ser que haja uma regulação do ciclo celular pelo composto, porém não observamos a mesma ação fenotípica como vista em T. cruzi. Além disso, este trabalho nos mostrou o potencial do HF para ser utilizado como uma sonda química em investigações sobre a replicação e o desenvolvimento do T. cruzi.
A doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi da classe Kinetoplastida, continua sendo uma das doenças tropicais mais negligenciadas do mundo. Estima-se que cerca de 6 a 7 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas pelo T. cruzi. O benznidazole (BNZ) e o nifurtimox (NFX), os únicos fármacos disponíveis para o tratamento da doença, estão associados a severos efeitos adversos e a uma eficácia pouco clara na fase crônica da infecção. A patogênese relacionada a essa doença ainda é pouco compreendida, o que reforça a importância de se pesquisar mais sobre a biologia básica da infecção, replicação e diferenciação de T. cruzi, pois somente dessa maneira novas estratégias de quimioterapia serão descobertas. Na ausência de alvos farmacológicos clinicamente validados, o desenvolvimento de novos ensaios de triagem fenotípica pode resultar na descoberta de compostos que possam induzir fenótipos relacionados a mecanismos distintos de ação até então não investigados. Neste trabalho, procuramos discutir a relevância da abordagem da triagem fenotípica para o entendimento da biologia celular do T. cruzi. A partir da triagem de alto conteúdo de uma biblioteca de 4 mil inibidores putativos de quinases, foram selecionados alguns compostos de interesse, os quais apresentaram baixa citotoxicidade e capacidade de induzir fenótipos específicos de interferência no desenvolvimento intracelular normal do parasita. Um desses compostos (denominado HF) inibiu a replicação do parasita sem causar perda de viabilidade celular. A caracterização funcional da atividade de HF mostrou que: (i) o fenótipo de parada do desenvolvimento intracelular não se restringiu a um tipo de célula hospedeira; (ii) o composto foi capaz de inibir a replicação de diferentes cepas de T. cruzi (Y, Sylvio X10/1 e CL Brener); (iii) o fenótipo de inibição da replicação parasitária foi reversível após a remoção do composto, uma vez que o parasita a partir desse ponto cresce normalmente e conclui seu ciclo intracelular por diferenciação para tripomastigotas; (iv) o composto não apresentou citotoxicidade para células hospedeiras distintas (U2OS, LLC-MK2, NRK-52E e BHK51) até a concentração máxima de 100 µM por 48 h, sendo altamente seletivo para o parasita; (v) a molécula também foi capaz de inibir a replicação da forma epimastigota de T. cruzi sem causar perda de viabilidade até 96 h, todavia apresentou atividade citocida concentração-dependente contra a forma sanguínea de Trypanosoma brucei e a forma promastigota de Leishmania donovani; e (vi) o composto causou um tipo de parada no ciclo celular de T. cruzi, fazendo com que a maioria da população celular permanecesse na fase G1 do ciclo, diferentemente do que foi observado em células tratadas com benznidazole. Em conjunto, os resultados que obtivemos sugerem que este composto age através de um regulador do ciclo celular que pode especificamente bloquear o ciclo celular em T. cruzi e não em células de mamíferos. Em relação aos outros tripanossomatídeos, pode ser que haja uma regulação do ciclo celular pelo composto, porém não observamos a mesma ação fenotípica como vista em T. cruzi. Além disso, este trabalho nos mostrou o potencial do HF para ser utilizado como uma sonda química em investigações sobre a replicação e o desenvolvimento do T. cruzi.
Descrição
Citação
ARAUJO JUNIOR, Adalberto Miguel. Caracterização funcional de um composto capaz de regular o desenvolvimento celular de Trypanosoma cruzi. 2019. 158f. Tese (Doutorado em Microbiologia e Imunologia) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.