Estudos De Biodisponibilidade E Biodistribuição Do Amblyomin-X Dissertação
Data
2017-01-31
Autores
Boufleur, Pamela 
Orientadores
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objectives: Amblyomin-X is a recombinant protein of 12,3 kDa that inhibits the blood coagulation factor Xa and induces tumor cell apoptosis and regression of melanoma in mice. Pharmacokinetic studies were needed for the identification and location of Amblyomin-X in healthy animais (tumor-free), to identify the speed 'of distribution and the extent to which the protein is absorbed into the systemic circulation until their excretion, and on which organs the protein has affinity with. Methods: Amblyomin-X was intravenously injected onto the retro orbital plexus of healthy female BALB/c mice in different concentrations (1 mg/Kg and 100 mg/Kg), multiple time post injection were evaluated in plasma, organs (thymus, heart, lung, liver and kidney) and urine for analysis. The analysis of organs and plasma was by SDS-PAGE and liquid chromatography-mass spectrometry (ESI-IT-TOF and MALDI-TOF). Urine samples were treated for the proper extraction of proteins and peptides and also analyzed by LC-MS. In parallel experiments were performed using plasma from mice at concentrations of 5, 50 and 200 mg/Kg in single dose and analyzed 24 hours after and the concentrations of 5 and 50 mg/Kg in repeated dosages of·14 and 28 days. Fluorescent-Iabeled Amblyomin-X (Ambly750S) was used for the evaluation of biodistribution kinetics in healthy animais. The treatment was performed in a single dose (1 mg/Kg) at different times and in daily dose (1 mg/Kg) for 14 days intravenously. Results: The Amblyomin-X at a concentration of 100 mg/Kg was found in the plasma immediately after application and remained detectable within 2 hours, with a Cmax of 38 ug/mL Tmax of 30 minutes. The Amblyomin-X was not detected in plasma samples what was analyzed 24 hours post the application of 5, 50 and 200 mg/Kg (single dose) and 5 to 50 mg/Kg injected daily for 14 and 28 days. In organs analyzed by ESI-IT-TOF Amblyomin-X was identified in thymus after 10 minutes to 6 h, heart in 45 minutes up to 12 h, lung 10 minutes up to 6 hours, spleen over 1 hour remaining detectable for 24 hours, in the liver 45 minutes 24 hours and in the kidney in 45 minutes remaining until 24 hours. Peptides were identified corresponding to the degraded Amblyomin-X in urine post 24 hours of application. Ambly750S was detected in the liver at 1 hour post application, and it started to be excreted via the renal route 4 hours after injection. Fluorescent signals were detected 26 hours in the urinary tract organs, especially the bladder. Conclusions: The xii Amblyomin-X has a quick exit from the plasma by the fact of not being bound to albumin. The Amblyomin-X remains in the body of healthy animais for up to 26 hours after application, was found in kidney up to 26 hours, indicating that the protein is not only metabolised by the liver but also by the kidney. After its passage through the kidney Amblyomin-X was found in the urine, indicating its route of elimination.
Objetivo: Amblyomin-X é uma proteína recombinante de 12,3 KDa, que inibe o fator Xa de coagulação sanguínea e induz apoptose de células tumorais e regressão do melanoma de camundongos. Estudos de farmacocinética se fez necessário para a identificação e localização do Amblyomin-X em animais saudáveis (sem tumor), para conhecer a velocidade e a extensão em que a proteína é absorvida pela circulação sistêmica até sua excreção, e em que órgãos a proteína tem afinidade. Métodos: Foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas saudáveis, nos quais foi injetado o Amblyomin-X em diferentes concentrações (1 mg/Kg e 100 mg/Kg), o plasma, os órgãos (timo, coração, pulmão, fígado e rim) e urina foram coletados em diferentes tempos para análise. A análise dos órgãos e plasma foi através de SDS-PAGE e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (ESI-IT-TOF e MALDITOF). No caso da urina, a mesma foi tratada para extração de proteínas e peptídeos e também analisada por LC-MS. Em paralelo foram realizados experimentos utilizando o plasma de camundongos nas concentrações de 5, 50 e 200 mg/Kg em dose única e analisados após 24 horas, e nas concentrações de 5"e 50 mg/Kg em doses repetidas de 14 e 28 dias. O Amblyomin-X foi conjugado a uma sonda fluorescente (Ambly750S), onde foi empregado para a avaliação da cinética de biodistribuição em animais saudáveis. O tratamento foi realizado em dose única (1 mg/Kg) sendo as amostras recolhidas em diferentes tempos e também em doses diárias (1 mg/Kg) por 14 dias, nos dois casos foi utilizado o plexo retro orbital como via intravenosa. Resultados: O Amblyomin-X na concentração de 100 mg/Kg foi encontrado no plasma imediatamente após a aplicação e permaneceu até 2 h, tendo sua Cmax de 38 I-Ig/mLno Tmax de 30 minutos. O Amblyomin-X não foi encontrado no plasma nas concentrações de 5, 50 e 200 mg/Kg (dose única) após 24h e 5 e 50 mg/Kg injetado diariamente por 14 e 28 dias. Nos órgãos analisados pelo ESI-ITTOF foi identificado no timo após 10 minutos até 6 horas, coração em 45 minutos até 12 horas, pulmão em 10 minutos até 6 horas, baço em 1 hora permanecendo até 24 horas, fígado 45 minutos até 24 horas e rim em 45 minutos permanecendo até 24 horas. Foram identificados peptídeos correspondentes ao Amblyomin-X na urina após 24 horas da aplicação. Ambly750S aparece no fígado em 1 hora após a aplicação e a partir de 4 horas começa a ser excretado pela via renal. Em 26 horas x há sinais fluorescentes nos órgãos do trato urinário, principalmente na bexiga. Conclusões: O Amblyomin-X tem uma rápida saída do plasma pelo fato de não estar ligado à albumina. O Amblyomin-X permanece nos animais saudáveis por até 26 horas após a sua aplicação, sendo encontrada no rim em até 26 horas, indicando que a proteína não está não sendo metabolizada somente pelo fígado, mas também pelo rim. Após sua passagem pelo rim o Amblyomin-X é encontrado na urina, indicando sua via de eliminação.
Objetivo: Amblyomin-X é uma proteína recombinante de 12,3 KDa, que inibe o fator Xa de coagulação sanguínea e induz apoptose de células tumorais e regressão do melanoma de camundongos. Estudos de farmacocinética se fez necessário para a identificação e localização do Amblyomin-X em animais saudáveis (sem tumor), para conhecer a velocidade e a extensão em que a proteína é absorvida pela circulação sistêmica até sua excreção, e em que órgãos a proteína tem afinidade. Métodos: Foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas saudáveis, nos quais foi injetado o Amblyomin-X em diferentes concentrações (1 mg/Kg e 100 mg/Kg), o plasma, os órgãos (timo, coração, pulmão, fígado e rim) e urina foram coletados em diferentes tempos para análise. A análise dos órgãos e plasma foi através de SDS-PAGE e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (ESI-IT-TOF e MALDITOF). No caso da urina, a mesma foi tratada para extração de proteínas e peptídeos e também analisada por LC-MS. Em paralelo foram realizados experimentos utilizando o plasma de camundongos nas concentrações de 5, 50 e 200 mg/Kg em dose única e analisados após 24 horas, e nas concentrações de 5"e 50 mg/Kg em doses repetidas de 14 e 28 dias. O Amblyomin-X foi conjugado a uma sonda fluorescente (Ambly750S), onde foi empregado para a avaliação da cinética de biodistribuição em animais saudáveis. O tratamento foi realizado em dose única (1 mg/Kg) sendo as amostras recolhidas em diferentes tempos e também em doses diárias (1 mg/Kg) por 14 dias, nos dois casos foi utilizado o plexo retro orbital como via intravenosa. Resultados: O Amblyomin-X na concentração de 100 mg/Kg foi encontrado no plasma imediatamente após a aplicação e permaneceu até 2 h, tendo sua Cmax de 38 I-Ig/mLno Tmax de 30 minutos. O Amblyomin-X não foi encontrado no plasma nas concentrações de 5, 50 e 200 mg/Kg (dose única) após 24h e 5 e 50 mg/Kg injetado diariamente por 14 e 28 dias. Nos órgãos analisados pelo ESI-ITTOF foi identificado no timo após 10 minutos até 6 horas, coração em 45 minutos até 12 horas, pulmão em 10 minutos até 6 horas, baço em 1 hora permanecendo até 24 horas, fígado 45 minutos até 24 horas e rim em 45 minutos permanecendo até 24 horas. Foram identificados peptídeos correspondentes ao Amblyomin-X na urina após 24 horas da aplicação. Ambly750S aparece no fígado em 1 hora após a aplicação e a partir de 4 horas começa a ser excretado pela via renal. Em 26 horas x há sinais fluorescentes nos órgãos do trato urinário, principalmente na bexiga. Conclusões: O Amblyomin-X tem uma rápida saída do plasma pelo fato de não estar ligado à albumina. O Amblyomin-X permanece nos animais saudáveis por até 26 horas após a sua aplicação, sendo encontrada no rim em até 26 horas, indicando que a proteína não está não sendo metabolizada somente pelo fígado, mas também pelo rim. Após sua passagem pelo rim o Amblyomin-X é encontrado na urina, indicando sua via de eliminação.