Desenvolvimento de novos materiais dentários: efeito do peptídeo autopolimerizante P11-4 e do trimetafosfato de sódio na degradação do colágeno I e na formação de Hidroxiapatita
Data
2020-09-24
Autores
Carvalho, Rafael Guzella De 
Orientadores
Tersariol, Ivarne Luis Dos Santos
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objectives: This study investigated the influence of peptide P11-4 (Ace-QQRFEWEFEQQ-NH2) and sodium trimetaphosphate (STMP) on the rate of calcium phosphate crystal growth, its anti-proteolytic action against the enzymatic degradation of type I collagen, the binding mechanism of P11-4 and STMP to collagen fibrils, and the potential mechanism to induce collagen stabilization. It was also evaluated the cell viability and the gene expression of different major genes involved in mineralization in odontoblast-like cells exposed to different concentrations of P11-4 and STMP. Methods: P11-4 interaction with calcium was analyzed by intrinsic fluorescence analysis. Crystalline particles formation was monitored by light-scattering detectors to estimate pH variation and radial size of the crystalline particles as a function of reaction time (pH 7.4, 25 ºC) in the presence of P11-4 or STMP in supersaturated calcium phosphate solution (Ca/P=1.67). Images were obtained under the atomic force microscopy (AFM) to measure the particle size in the presence of P11-4 or STMP and to measure the width of collagen fibrils in the presence of P11-4. The interaction of P11-4 and collagen I was analyzed by surface plasmon resonance (SPR). The binding mechanism of P11-4 and STMP to collagen fibrils were assessed with intrinsic fluorescence analysis and circular dichroism spectrometry (CD) respectively. Immortalized rat odontoblast cells (MDPC-23) were cultured. Cell viability was assessed by Trypan Blue staining and MTT assay. The changes in gene expression balance induced by P11-4 and STMP were assessed by qRT-PCR assays. Three-point bending test was used to obtain the elastic modulus of fully demineralized dentin beams before and after immersion in STMP solutions. We also performed assays of bond strength to microtensile, nanoinfiltration and in situ zymography to assess the effects of P11-4 on stabilizing the structure of dentine carie-affected. Data was statistically analyzed (α=0.05). Results: Intrinsic fluorescence analysis, dynamical light scattering with pH monitoring and AFM showed P11-4 induces hydroxyapatite (HAP) crystal nucleation process improving the structural match among HAP crystallite aggregates. STMP greatly increased the rate of crystal growth, significantly increasing the average radial crystal size. AFM corroborated the significant increase of STPM treated crystal size. SPR and AFM indicated that P11-4 binds to collagen type I fibers, increasing their width from 214 ± 4 nm to 308 ± 5 nm (P < 0.0001). The CD and intrinsic xvii fluorescence analysis showed the peptide sequence Ace-KGHRGFSGL-NH2 is the binding site of P11-4 and STMP in type I collagen. CD analysis demonstrated changes in the conformational stability after STMP binding to type I collagen. Mineralized collagen I fibrils exhibited less collagenase degradation with lower STMP concentration. P11-4 also increased the resistance of collagen type I fibers against the proteolytic activity of collagenases. We verified from the analysis of the elastic module for the treated substrate STMP and the analysis of nanoinfiltration, bond strength to microtensile and in situ zymography of the caries-affected dentin treated with P11-4 that these biomaterials stabilize the extracellular dentinal matrix. P11-4 and STMP had no significance influence in the cell viability of MDPC-23 cells and only P11-4 had significant influence in gene expression of these cells. Conclusion: The present study observed that P11-4 and STMP induces the nucleation of hydroxyapatite, interacts with collagen type I and increased resistance of collagen against the proteolytic activity of collagenases, improving the mechanical properties of the extracellular dentin matrix.
Objetivos: Este estudo investigou a influência do peptídeo P11-4 (Ace-QQRFEWEFEQQ-NH2) e do trimetafosfato de sódio (STMP) na velocidade de crescimento de cristais de fosfato de cálcio, suas ações anti-proteolíticas contra a degradação enzimática do colágeno tipo I, o mecanismo de ligação do P11-4 e do STMP às fibrilas de colágeno e o mecanismo potencial para induzir a estabilização do colágeno. Também foi avaliada a viabilidade celular e a expressão gênica de diferentes genes importantes envolvidos na mineralização em células de odontoblásticas expostas a diferentes concentrações de P11-4 e STMP. Métodos: A interação do P11-4 com cálcio foi analisada por análise da fluorescência intrínseca. A formação de partículas cristalinas foi monitorada por detectores de light-scattering para obter a variação do pH e o tamanho do raio das partículas cristalinas em função do tempo de reação (pH 7,4; 25 ºC) na presença de P11-4 ou STMP em solução supersaturada de fosfato de cálcio (Ca/P=1,67). Imagens de microscopia de força atômica (AFM) foram obtidas para medir o tamanho das partículas na presença de P11-4 ou STMP e da largura das fibrilas de colágeno na presença de P11-4. A interação de P11-4 e colágeno I foi analisada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). O mecanismo de ligação do P11-4 e do STMP às fibrilas de colágeno I foi avaliado por análise da fluorescência intrínseca e espectrometria de dicroísmo circular (CD), respectivamente. Células odontoblásticas de rato imortalizadas (MDPC-23) foram cultivadas. A viabilidade celular foi avaliada por coloração com Azul de Tripan e ensaio de MTT. As alterações no equilíbrio da expressão gênica induzidas por P11-4 e STMP foram avaliadas por ensaios de qRT PCR. O teste de resistência à flexão por três pontos foi utilizado para obter o módulo elástico de feixes de dentina totalmente desmineralizadas, antes e após imersão em soluções STMP, também realizamos os ensaios de resistência de união à microtração, nanoinfiltração e zimografia in situ para avaliar os efeitos do P11-4 na estabilização da estrutura da dentina afetada por cárie. Os dados foram analisados estatisticamente (α = 0,05). Resultados: A análise da fluorescência intrínseca, light-scattering com monitoramento de pH e AFM mostraram que o P11-4 induz o processo de nucleação do cristal de hidroxiapatita (HAP), melhorando a correspondência estrutural entre os agregados cristalinos de HAP. O STMP aumentou a taxa de crescimento dos cristais, xv elevando significativamente o tamanho médio do raio dos cristais. AFM corroborou o aumento significativo do tamanho do cristal tratado com STPM. SPR e AFM indicaram que P11-4 se liga a fibras de colágeno tipo I, aumentando sua largura de 214 ± 4 nm para 308 ± 5 nm (P <0,0001). A análise de CD e de fluorescência intrínseca mostrou que a sequência peptídica Ace-KGHRGFSGL-NH2 é o sítio de ligação de P11-4 e STMP no colágeno tipo I. A análise de CD demonstrou alterações na estabilidade conformacional após a ligação do STMP ao colágeno tipo I. As fibrilas de colágeno I mineralizadas exibiram menor degradação por colagenase com baixa concentração de STMP. O P11-4 também aumentou a resistência das fibras de colágeno tipo I contra a atividade proteolítica das colagenases. Verificamos pelos resultados obtidos da análise do módulo elástico para o substrato tratado STMP, pela análises de nanoinfiltração, resistência da união à microtração e zimografia in situ da dentina cárie-afetada tratada com P11-4 que esses biomaterias estabilizam a matriz extracelular dentinária. P11-4 e STMP não tiveram influência significativa na viabilidade celular das células MDPC-23 e apenas P11-4 teve influência significativa na expressão gênica dessas células. Conclusão: O presente estudo observou que P11-4 e STMP induzem a nucleação da hidroxiapatita, interagem com o colágeno tipo I e aumentam a resistência do colágeno contra a atividade proteolítica das colagenases, melhorando as propriedades mecânicas da matriz extracelular dentinária.
Objetivos: Este estudo investigou a influência do peptídeo P11-4 (Ace-QQRFEWEFEQQ-NH2) e do trimetafosfato de sódio (STMP) na velocidade de crescimento de cristais de fosfato de cálcio, suas ações anti-proteolíticas contra a degradação enzimática do colágeno tipo I, o mecanismo de ligação do P11-4 e do STMP às fibrilas de colágeno e o mecanismo potencial para induzir a estabilização do colágeno. Também foi avaliada a viabilidade celular e a expressão gênica de diferentes genes importantes envolvidos na mineralização em células de odontoblásticas expostas a diferentes concentrações de P11-4 e STMP. Métodos: A interação do P11-4 com cálcio foi analisada por análise da fluorescência intrínseca. A formação de partículas cristalinas foi monitorada por detectores de light-scattering para obter a variação do pH e o tamanho do raio das partículas cristalinas em função do tempo de reação (pH 7,4; 25 ºC) na presença de P11-4 ou STMP em solução supersaturada de fosfato de cálcio (Ca/P=1,67). Imagens de microscopia de força atômica (AFM) foram obtidas para medir o tamanho das partículas na presença de P11-4 ou STMP e da largura das fibrilas de colágeno na presença de P11-4. A interação de P11-4 e colágeno I foi analisada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). O mecanismo de ligação do P11-4 e do STMP às fibrilas de colágeno I foi avaliado por análise da fluorescência intrínseca e espectrometria de dicroísmo circular (CD), respectivamente. Células odontoblásticas de rato imortalizadas (MDPC-23) foram cultivadas. A viabilidade celular foi avaliada por coloração com Azul de Tripan e ensaio de MTT. As alterações no equilíbrio da expressão gênica induzidas por P11-4 e STMP foram avaliadas por ensaios de qRT PCR. O teste de resistência à flexão por três pontos foi utilizado para obter o módulo elástico de feixes de dentina totalmente desmineralizadas, antes e após imersão em soluções STMP, também realizamos os ensaios de resistência de união à microtração, nanoinfiltração e zimografia in situ para avaliar os efeitos do P11-4 na estabilização da estrutura da dentina afetada por cárie. Os dados foram analisados estatisticamente (α = 0,05). Resultados: A análise da fluorescência intrínseca, light-scattering com monitoramento de pH e AFM mostraram que o P11-4 induz o processo de nucleação do cristal de hidroxiapatita (HAP), melhorando a correspondência estrutural entre os agregados cristalinos de HAP. O STMP aumentou a taxa de crescimento dos cristais, xv elevando significativamente o tamanho médio do raio dos cristais. AFM corroborou o aumento significativo do tamanho do cristal tratado com STPM. SPR e AFM indicaram que P11-4 se liga a fibras de colágeno tipo I, aumentando sua largura de 214 ± 4 nm para 308 ± 5 nm (P <0,0001). A análise de CD e de fluorescência intrínseca mostrou que a sequência peptídica Ace-KGHRGFSGL-NH2 é o sítio de ligação de P11-4 e STMP no colágeno tipo I. A análise de CD demonstrou alterações na estabilidade conformacional após a ligação do STMP ao colágeno tipo I. As fibrilas de colágeno I mineralizadas exibiram menor degradação por colagenase com baixa concentração de STMP. O P11-4 também aumentou a resistência das fibras de colágeno tipo I contra a atividade proteolítica das colagenases. Verificamos pelos resultados obtidos da análise do módulo elástico para o substrato tratado STMP, pela análises de nanoinfiltração, resistência da união à microtração e zimografia in situ da dentina cárie-afetada tratada com P11-4 que esses biomaterias estabilizam a matriz extracelular dentinária. P11-4 e STMP não tiveram influência significativa na viabilidade celular das células MDPC-23 e apenas P11-4 teve influência significativa na expressão gênica dessas células. Conclusão: O presente estudo observou que P11-4 e STMP induzem a nucleação da hidroxiapatita, interagem com o colágeno tipo I e aumentam a resistência do colágeno contra a atividade proteolítica das colagenases, melhorando as propriedades mecânicas da matriz extracelular dentinária.