Desenvolvimento da técnica de quantificação de exons (TQE) para a detecção de grandes deleções e inserções no gene SERPING1 para o diagnóstico de angiodema hereditário
Data
2017
Autores
Amorim, Priscila Nicolicht de 
Orientadores
Pesquero, João Bosco Pesquero
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Hereditary angioedema (HAE) is a genetic disease caused by mutations in SERPING1 gene encoding the inhibitor of C1 esterase (C1-INH), determining the quantitative and/or qualitative deficiency in C1-INH, largely caused by point mutations and approximately 15 -20%, related to the major gene rearrangements. The intronic gene regions have 17 sequences of repetitive elements represented by Alu, making it prone to deletions and insertions gene/duplications. To enable a semiquantitative molecular diagnosis for SERPING1 gene with the capacity to detect large gene rearrangements, was developed and standardized one technique to quantity the exons (EOT). Through capillary electrophoresis was performed separation and quantification of different sized fragments amplified by Multiplex PCR-technique associated with the use of primers labeled with a fluorescent molecule. It was selected sample of blood from a family with clinical history of HAE, low serum C4 and C1-INH, and who were admitled to molecular analysis of SERPING1 gene by sequencing Sanger in our Center. Samples of this family showed no pathogenic known change in SERPING1 gene by Sanger sequencing technique. So, they were analyzed by TOE confirmed by PCR and MLPA Long Range. Th.[ough TOE was deteded deletion in exon 4 in the patient 12 and confirmed by the MLPA. The deleted fragment was separated by Long Range PCR and subsequently by Sanger sequencing, were found the location and size of the deletion. Therefore, the quantification technique Exons (TOE) proved to be an efficient method for the detection of large deletions or insertions/duplication with power efficiency is simple and fast implementation, in addition to a benefit cost. These data show that SO technique successfully developed for the deletion analysis involving SERPING1 gene, serving as support technique in routine laboratory diagnosis of HAE and may be further standardized and applied to other genetic diseases, contributing to the research and detection major gene rearrangements.
O Angioedema Hereditário (AEH) é uma doença genética decorrente de mutações no gene SERPING1 que codifica o inibidor de C1 esterase (C1-INH), determinando deficiência quantitativa e/ou qualitativa no C1-INH, causado em maior parte por mutações pontuais e, aproximadamente 15-20%, referentes a grandes rearranjos gênicos. As regiões intrônicas do gene apresentam 17 sequências de elementos repetitivos representados por A/u, tornando o gene propenso a deleções e inserções/duplicações. Para viabilizar um diagnóstico molecular semiquantitativo para o gene SERPING1 com capacidade de detecção de grandes rearranjos gênicos foi desenvolvida e padronizada uma Técnica de Ouantificação de Exons (TOE). Através da eletroforese capilar, foi realizada a separação e quantificação dos fragmentos de diferentes tamanhos amplificados pela técnica de PCR-Multiplex associada à utilização de prímers marcados com molécula fluorescente. Foi selecionada amostra de sangue de uma família com histórico clínico de AEH, níveis séricos baixos de C4 e C1-INH, e que deram entrada para análise molecular do gene SERPING1 por sequenciamento de Sanger em nosso Centro. As amostras dessa família não apresentaram nenhuma alteração patogênica conhecida no gene .> SERPING1 pela técnica de sequenciamento de Sanger. Sendo assim, foram analisados por TOE, confirmados por MLPA e PCR de Longo Alcance. Através do TOE foi detectado deleção no exon 4 no paciente nO12 e confirmado pelo MLPA. O fragmento deletado foi separado por PCR Longo Alcance e, posteriormente, pelo sequenciamento de Sanger, foram localizados o local e o tamanho da deleção. Portanto, a Técnica de Ouantificação de Exons (TOE) mostrou ser um método eficiente na detecção de grandes deleções ou inserções/duplicações com poder de eficiência sendo simples e rápida na execução, além de ter um custo benefício. Estes dados revelam que a técnica de TOE foi desenvolvida com sucesso para a análise de deleções envolvendo o gene SERPING1, servindo como técnica de suporte na rotina laboratorial no diagnóstico de AEH, podendo ser ainda padronizada e aplicada para outras doenças genéticas, contribuindo na pesquisa e detecção de grandes rearranjos gênicos. XIV
O Angioedema Hereditário (AEH) é uma doença genética decorrente de mutações no gene SERPING1 que codifica o inibidor de C1 esterase (C1-INH), determinando deficiência quantitativa e/ou qualitativa no C1-INH, causado em maior parte por mutações pontuais e, aproximadamente 15-20%, referentes a grandes rearranjos gênicos. As regiões intrônicas do gene apresentam 17 sequências de elementos repetitivos representados por A/u, tornando o gene propenso a deleções e inserções/duplicações. Para viabilizar um diagnóstico molecular semiquantitativo para o gene SERPING1 com capacidade de detecção de grandes rearranjos gênicos foi desenvolvida e padronizada uma Técnica de Ouantificação de Exons (TOE). Através da eletroforese capilar, foi realizada a separação e quantificação dos fragmentos de diferentes tamanhos amplificados pela técnica de PCR-Multiplex associada à utilização de prímers marcados com molécula fluorescente. Foi selecionada amostra de sangue de uma família com histórico clínico de AEH, níveis séricos baixos de C4 e C1-INH, e que deram entrada para análise molecular do gene SERPING1 por sequenciamento de Sanger em nosso Centro. As amostras dessa família não apresentaram nenhuma alteração patogênica conhecida no gene .> SERPING1 pela técnica de sequenciamento de Sanger. Sendo assim, foram analisados por TOE, confirmados por MLPA e PCR de Longo Alcance. Através do TOE foi detectado deleção no exon 4 no paciente nO12 e confirmado pelo MLPA. O fragmento deletado foi separado por PCR Longo Alcance e, posteriormente, pelo sequenciamento de Sanger, foram localizados o local e o tamanho da deleção. Portanto, a Técnica de Ouantificação de Exons (TOE) mostrou ser um método eficiente na detecção de grandes deleções ou inserções/duplicações com poder de eficiência sendo simples e rápida na execução, além de ter um custo benefício. Estes dados revelam que a técnica de TOE foi desenvolvida com sucesso para a análise de deleções envolvendo o gene SERPING1, servindo como técnica de suporte na rotina laboratorial no diagnóstico de AEH, podendo ser ainda padronizada e aplicada para outras doenças genéticas, contribuindo na pesquisa e detecção de grandes rearranjos gênicos. XIV
Descrição
Citação
AMORIM, Priscila Nicolicht de. Desenvolvimento da técnica de quantificação de exons (tqe) para a detecção de grandes deleções e inserções no gene serping1 para o diagnóstico de angiodema hereditário. 2017. 95 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2017.