Caracterização de epitopos contendo resíduos de alfa-galactopiranosil em Paracoccidioides e outros fungos patogênicos
Data
2019-08-29
Autores
Gegembauer, Gregory 
Orientadores
Puccia, Rosana
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The main focus of this work was to find αGal epitopes (terminal α-galactopisyl) in fungi of medical importance, considering that there is little information regarding the possible roles of these glycotopes in pathogenic fungal systems. Our project aimed at expanding the group’s reported observation that yeast cells from Paracoccidioides brasiliensis Pb18 reacted with anti-αGal antibodies from chagasic patients (Ch-anti-αGal) on the cell wall and inside intracellular vacuoles. Those results were obtained during the characterization of αGal epitopes in extracellular vesicles produced by P. brasiliensis Pb18 and Pb3 using Ch-antiαGal and anti-αGal IgGs isolated from paracoccidioidomycosis patients, as well MOA lectin specific to Galα1,3Gal disaccharide. Our present confocal microscopy results using Ch-anti-αGal antibodies suggested the presence of αGal epitopes in Pb18, Pb3, Pb01, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Cryptococcus capsulatum, and Aspergillus fumigatus. The reactivity was visualized inside vacuoles and on the cell wall of mother cells and buds, especially at bud scar and bud necks. C. neoformans yeasts were labeled only at the cell wall in our experimental conditions. Ch-anti-αGal antibodies were also localized in the filamentous phase of Pb18 and H. capsulatum, mostly in the hyphae cytoplasm. In A. fumigatus, label predominated at the phialides surface. During the Pb18 mycelium to yeast phase, Ch-antiαGal antibodies intensely labeled transition round structures, thus suggesting a role in yeast formation. Additionally, the presence of αGal epitopes in the studied fungal species was strongly suggested by the effect of α-galactosidase treatment, which evoked intense cell aggregation. Altogether these results suggest the presence of αGal epitopes in several pathogenic fungi, both in the yeast and mycelium phases. An extended in silico analysis using fungal data banks has shown the presence of potential αgalactosyltransferase genes in all fungal species analyzed in this study, in view of the sequence homology with α-galactosyltransferases (αGTs) well described in Schizosaccharomyces pombe. We used as templates the sequences of seven α1,2- and three α1,3-galactosiltransferases. There were similar sequences to α1,2-GT GMH4 and GMH5 (GT34 family), as well to OTGs α1,3-GT (GT8 family). The gene expression of related genes was analyzed between mycelium and yeast phases. The RT-PCR results suggest, in our conditions, that the Pb01 GMH5-like gene was more transcribed than that from Pb3 and Pb18 in both phases. The GMH-like genes were considerably more expressed during the yeast phase in all isolates than in the mycelium phase. These results suggest that there are potential αGT genes being expressed in P. brasiliensis and P. lutzii, however the mRNA accumulation varies with the isolate, cell phase and culture conditions. The overall data presented in this thesis are totally original in the field of pathogenic fungi and upgrade the knowledge about αGal epitopes, which can potentially have important roles in pathogenesis of mycosis, thus mirroring what happens in Chaga’s disease.
O objetivo central deste trabalho foi verificar a presença de epitopos αGal(α-galactopiranosil) em fungos de importância médica, considerando que esses glicotopos e seu papel em sistemas fúngicos são pouco conhecidos. O projeto visou expandir a observação publicada pelo grupo de que leveduras de Paracoccidioides brasiliensis Pb18 reagiram com anticorpos anti-αGal de pacientes chagásicos (Ch-anti-αGal) tanto na parede celular, como em vacúolos intracelulares. Essa observação foi realizada durante a caracterização de epitopos αGal em vesículas extracelulares oriundas de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 utilizando Ch-anti-αGal e anticorpos anti-αGal isolados de pacientes com paracoccidioidomicose, além da lectina MOA, que se liga especificamente em resíduos terminais de Galα1,3Gal. Os resultados de microscopia confocal com anticorpos Ch-anti-αGal sugeriram a presença de epitopos αGal na parede celular (especialmente nas regiões de brotamento e cicatriz do broto) e no citoplasma de leveduras de Paracoccidioides Pb18, Pb3, Pb01, Histoplasma capsulatum e Candida albicans, como também na parede celular de leveduras de Cryptococcus neoformans. Além disso, houve marcação dos anticorpos em hifas de P. brasiliensis Pb18 e H. capsulatum, notadamente na região intracelular, bem como na a superfície de fiálides de Aspergillus fumigatus. Células de Pb18 em transição de micélio para levedura apresentaram intensa fluorescência em estruturas arredondadas, sugerindo um papel das moléculas reativas com Ch-anti-αGal na transição. A presença de epitopos αGal na superfície das espécies fúngicas estudadas foi sugerida adicionalmente pela ação da enzima α-galactosiltransferase, a qual provocou intensa agregação celular. Esses resultados sugerem que epitopos αGal são expressos em muitas espécies de fungos patogênicos, tanto em leveduras como em hifas. Uma extensa análise de bancos de dados mostrou a presença de genes de αgalactosiltransferases potenciais nos fungos estudados, dada a homologia das correspondentes sequências de aminoácidos com aquelas caracterizadas em Schizosacharomyces pombe. Nas buscas, foram usadas como molde sete sequências de α1,2- e três de α1,3-galactosiltransferases (αGT). Foram encontradas e analisadas sequências similares às α1,2-GT GMH5 e GMH4 (família GT34) e às α1,3-GT OTGs (família GT8). A expressão dos genes foi verificada nas fases de micélio e levedura. Os resultados de RT-PCR sugeriram que, em nossas condições experimentais, o gene GMH5-like de Pb01 foi mais expresso do que os correspondentes em Pb3 e Pb18 nas duas fases. Os genes GMH-like foram consideravelmente mais expressos durante a fase de levedura do que de micélio nos três isolados. Ou seja, genes potencias de αGT são expressos em P. brasiliensis e P. lutzii, porém o acúmulo de mRNA é fase dependente e varia com o isolado em nossas condições de cultura. Os dados apresentados neste trabalho de tese são totalmente originais em fungos patogênicos e ampliam o conhecimento sobre epitopos αGal, os quais podem potencialmente ter um papel nas micoses assim como acontece na doença de Chagas.
O objetivo central deste trabalho foi verificar a presença de epitopos αGal(α-galactopiranosil) em fungos de importância médica, considerando que esses glicotopos e seu papel em sistemas fúngicos são pouco conhecidos. O projeto visou expandir a observação publicada pelo grupo de que leveduras de Paracoccidioides brasiliensis Pb18 reagiram com anticorpos anti-αGal de pacientes chagásicos (Ch-anti-αGal) tanto na parede celular, como em vacúolos intracelulares. Essa observação foi realizada durante a caracterização de epitopos αGal em vesículas extracelulares oriundas de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 utilizando Ch-anti-αGal e anticorpos anti-αGal isolados de pacientes com paracoccidioidomicose, além da lectina MOA, que se liga especificamente em resíduos terminais de Galα1,3Gal. Os resultados de microscopia confocal com anticorpos Ch-anti-αGal sugeriram a presença de epitopos αGal na parede celular (especialmente nas regiões de brotamento e cicatriz do broto) e no citoplasma de leveduras de Paracoccidioides Pb18, Pb3, Pb01, Histoplasma capsulatum e Candida albicans, como também na parede celular de leveduras de Cryptococcus neoformans. Além disso, houve marcação dos anticorpos em hifas de P. brasiliensis Pb18 e H. capsulatum, notadamente na região intracelular, bem como na a superfície de fiálides de Aspergillus fumigatus. Células de Pb18 em transição de micélio para levedura apresentaram intensa fluorescência em estruturas arredondadas, sugerindo um papel das moléculas reativas com Ch-anti-αGal na transição. A presença de epitopos αGal na superfície das espécies fúngicas estudadas foi sugerida adicionalmente pela ação da enzima α-galactosiltransferase, a qual provocou intensa agregação celular. Esses resultados sugerem que epitopos αGal são expressos em muitas espécies de fungos patogênicos, tanto em leveduras como em hifas. Uma extensa análise de bancos de dados mostrou a presença de genes de αgalactosiltransferases potenciais nos fungos estudados, dada a homologia das correspondentes sequências de aminoácidos com aquelas caracterizadas em Schizosacharomyces pombe. Nas buscas, foram usadas como molde sete sequências de α1,2- e três de α1,3-galactosiltransferases (αGT). Foram encontradas e analisadas sequências similares às α1,2-GT GMH5 e GMH4 (família GT34) e às α1,3-GT OTGs (família GT8). A expressão dos genes foi verificada nas fases de micélio e levedura. Os resultados de RT-PCR sugeriram que, em nossas condições experimentais, o gene GMH5-like de Pb01 foi mais expresso do que os correspondentes em Pb3 e Pb18 nas duas fases. Os genes GMH-like foram consideravelmente mais expressos durante a fase de levedura do que de micélio nos três isolados. Ou seja, genes potencias de αGT são expressos em P. brasiliensis e P. lutzii, porém o acúmulo de mRNA é fase dependente e varia com o isolado em nossas condições de cultura. Os dados apresentados neste trabalho de tese são totalmente originais em fungos patogênicos e ampliam o conhecimento sobre epitopos αGal, os quais podem potencialmente ter um papel nas micoses assim como acontece na doença de Chagas.