Interação de moléculas sintéticas anfifílicas catiônicas com modelos miméticos de biomembranas
Data
2018-09-27
Autores
Almeida, Marcio Moreira de 
Orientadores
Riske, Karin do Amaral
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Bacterial infections represent a serious health problem, aggravated by the resistance of
these microorganisms to conventional antibiotic agents. Therefore, alternative treatments,
such as those based on antimicrobial peptides and synthetic molecules with similar
characteristics, have been recently sought. Antimicrobial peptides are amphiphilic and
cationic molecules present in the immune system of plants and animals that cause the
death of microorganisms through the destruction of their membrane. In this work, two
classes of synthetic cationic amphiphilic molecules with possible antimicrobial action were
studied. These molecules consist of two hydrocarbon chains and two ammonium groups,
located at the ends of the hydrophobic chains (Bolalike)
or polar region of the molecule
(Geminilike).
In addition, different lengths of amphiphilic hydrocarbon chains were tested.
The molecules studied were B7, B11, G7 and G11, where the letter identifies the class
(Bola or Gemini) and the numbers the length of the acyl chain. To understand the
mechanism of action of these molecules, membrane mimetic models were used: large
(LUVs) and giant (GUVs) unilamellar vesicles composed of POPC, a zwitterionic lipid,
and POPG, an anionic lipid. The composition of POPC:POPG 7:3 was chosen to mimic
bacterial membranes, whereas pure POPC bilayers were used as biomimetic model of
eukaryotic membranes. Different techniques were used to evaluate the interaction
between the amphiphilic molecules and the LUVs: isothermal titration calorimetry (ITC), to
obtain information about the thermodynamics of the interaction, dynamic scattering (DLS)
and zeta potential of the vesicles to measure the size and surface charge of the vesicles
as the cationic molecules were added, and leakage assays of a fluorescence probe
encapsulated in the LUVs to quantify the lytic activity of the molecules. In addition, GUV
optical microscopy experiments were performed to visualize the effects caused by
amphiphilic molecules on the membrane. The results show that both the hydrophilic and
hydrophobic balance of the molecules and the positions of the charges (Bola or Gemini)
have an effect on the activity and mechanism of action of these molecules. Geminilike
molecules showed greater affinity for the membrane, but this affinity did not result in a
considerable membrane permeabilization. On the other hand, even though Bolalike
molecules did not exhibit such high membrane affinity, they caused considerable
membrane permeabilization. Among the amphiphilic molecules tested, the molecule B11
presented a lytic activity comparable to that of antimicrobial peptides and is, therefore,
the most promising molecule as a possible antimicrobial agent.
Infecções bacterianas representam um sério problema sanitário, agravado pela resistência destes microrganismos a agentes antibióticos convencionais. Portanto, tratamentos alternativos, como os baseados em peptídeos antimicrobianos e moléculas sintéticas com características similares, têm sido buscados recentemente. Peptídeos antimicrobianos são moléculas anfifílicas e catiônicas presentes no sistema imune de plantas e animais que causam a morte de microrganismos através da desestruturação da sua membrana. Neste trabalho, duas classes de moléculas anfifílicas catiônicas sintéticas com possível ação antimicrobiana foram estudadas. Essas moléculas consistem de duas cadeias hidrocarbônicas e dois grupos amônio, localizados nas extremidades das cadeias hidrofóbicas (Bolalike) ou na região polar da molécula (Geminilike). Além disso, diferentes comprimentos de cadeias hidrocarbônicas dos anfifílicos foram testados. As moléculas estudadas foram B7, B11, G7 e G11, onde a letra identifica a classe (Bola ou Gemini) e os números o comprimento da cadeia acila. Para compreender o mecanismo de ação dessas moléculas, modelos miméticos da membrana foram utilizados: vesículas unilamelares grandes (LUVs) e gigantes (GUVs) compostas de POPC, um lipídio zwiteriônico, e POPG, um lipídio aniônico. A composição de POPC:POPG 7:3 foi escolhida para mimetizar membranas bacterianas, enquanto que bicamadas de POPC puro foram usadas como modelo biomimético de membranas de eucariotos. Diferentes técnicas foram empregadas para avaliar a interação entre as moléculas anfifílicas e as LUVs: calorimetria de titulação isotérmica (ITC), para obter informação sobre a termodinâmica da interação, medidas conjuntas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) e de potencial zeta das vesículas para medir o tamanho e carga superficial das vesículas à medida em que as moléculas catiônicas eram adicionadas, e ensaios de vazamento de uma sonda fluorescente encapsulada nas LUVs para quantificar a atividade lítica das moléculas. Além disso, foram realizados experimentos de microscopia óptica de GUVs, para visualizar os efeitos causados pelas moléculas anfifílicas na membrana. Os resultados obtidos mostram que tanto o balanço hidrofílico e hidrofóbico das moléculas quanto a posição das cargas (Bola ou Gemini) têm efeito sobre a atividade e mecanismo de ação dessas moléculas. As moléculas Geminilike apresentaram maior afinidade pela membrana, mas esta afinidade não resultou em uma permeabilização considerável da membrana. Por outro lado, embora as moléculas Bolalike não tenham apresentado uma afinidade elevada pela membrana, causaram uma alta permeabilização. Dentre as moléculas anfifílicas testadas, a molécula B11 apresentou uma atividade lítica comparável com a de peptídeos antimicrobianos e é, portanto, a molécula mais promissora como possível agente antimicrobiano.
Infecções bacterianas representam um sério problema sanitário, agravado pela resistência destes microrganismos a agentes antibióticos convencionais. Portanto, tratamentos alternativos, como os baseados em peptídeos antimicrobianos e moléculas sintéticas com características similares, têm sido buscados recentemente. Peptídeos antimicrobianos são moléculas anfifílicas e catiônicas presentes no sistema imune de plantas e animais que causam a morte de microrganismos através da desestruturação da sua membrana. Neste trabalho, duas classes de moléculas anfifílicas catiônicas sintéticas com possível ação antimicrobiana foram estudadas. Essas moléculas consistem de duas cadeias hidrocarbônicas e dois grupos amônio, localizados nas extremidades das cadeias hidrofóbicas (Bolalike) ou na região polar da molécula (Geminilike). Além disso, diferentes comprimentos de cadeias hidrocarbônicas dos anfifílicos foram testados. As moléculas estudadas foram B7, B11, G7 e G11, onde a letra identifica a classe (Bola ou Gemini) e os números o comprimento da cadeia acila. Para compreender o mecanismo de ação dessas moléculas, modelos miméticos da membrana foram utilizados: vesículas unilamelares grandes (LUVs) e gigantes (GUVs) compostas de POPC, um lipídio zwiteriônico, e POPG, um lipídio aniônico. A composição de POPC:POPG 7:3 foi escolhida para mimetizar membranas bacterianas, enquanto que bicamadas de POPC puro foram usadas como modelo biomimético de membranas de eucariotos. Diferentes técnicas foram empregadas para avaliar a interação entre as moléculas anfifílicas e as LUVs: calorimetria de titulação isotérmica (ITC), para obter informação sobre a termodinâmica da interação, medidas conjuntas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) e de potencial zeta das vesículas para medir o tamanho e carga superficial das vesículas à medida em que as moléculas catiônicas eram adicionadas, e ensaios de vazamento de uma sonda fluorescente encapsulada nas LUVs para quantificar a atividade lítica das moléculas. Além disso, foram realizados experimentos de microscopia óptica de GUVs, para visualizar os efeitos causados pelas moléculas anfifílicas na membrana. Os resultados obtidos mostram que tanto o balanço hidrofílico e hidrofóbico das moléculas quanto a posição das cargas (Bola ou Gemini) têm efeito sobre a atividade e mecanismo de ação dessas moléculas. As moléculas Geminilike apresentaram maior afinidade pela membrana, mas esta afinidade não resultou em uma permeabilização considerável da membrana. Por outro lado, embora as moléculas Bolalike não tenham apresentado uma afinidade elevada pela membrana, causaram uma alta permeabilização. Dentre as moléculas anfifílicas testadas, a molécula B11 apresentou uma atividade lítica comparável com a de peptídeos antimicrobianos e é, portanto, a molécula mais promissora como possível agente antimicrobiano.