Avaliação dos mecanismos de virulência e do fitness bacteriano de isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae produtores de KPC-2

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Data
2016-07-26
Autores
Visconde, Marina Francisco [UNIFESP]
Orientadores
Gales, Ana Cristina [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Objective: The aim of this study was to evaluate and compare the virulence and bacterial fitness of KPC-2-producing-K. pneumoniae isolates. Methods: A total of 30 K. pneumoniae clinical isolates distributed in three distinct groups, KPC-2-producing, ES?L-producing and community-acquired, were evaluated in this study. The genetic similarity among the isolates was determined by PFGE and MLST techniques. The antimicrobial susceptibility profile was determined by agar dilution and broth microdilution methodologies. The research of resistance and virulence genes were performed by PCR followed by DNA sequencing. OMPs characterization was evaluated by PCR, sequencing and SDS-PAGE techniques. For the in vitro evaluation of virulence factors, phenotypic tests were performed, such as the presence of hypermucoviscosity, biofilm formation, heat resistance, resistance to human serum, hemolysin production and phagocytosis by macrophages. The infection models using C. elegans and G. mellonella were performed for the evaluation of the in vivo virulence factors. The bacterial fitness was evaluated by measuring the growth rate of the isolates. Results: The genetic relationships evaluation showed the presence of 26 distinct PFGE patterns (A-Z) and 24 different STs distributed among 30 clinical isolates. High resistance rates to the antimicrobials agents tested were observed among KPC and ES?L groups. The resistance genes blaKPC, blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, and blaOKP were found in KPC and ES?L groups, while only the blaSHV and blaLEN genes were found in the community group. All isolates showed alterations in OmpK36. The PCR revealed the presence of virulence genes clpK, rmpA, mrkD, fimH, kpn, ycfm, kfu, Aero1, Aero2, iutA, entB, ybtS, fyuA and traT in all groups of this study. The hypermucoviscosity phenotype was found in only three isolates. All isolates were resistant to the factors present in human serum and able to form biofilms. All clpk carrying isolates survived the thermal shock, excepted isolated A23177. None of the isolates was able to produce hemolysin. Significant susceptibility differences in phagocytosis were observed in the KPC-2 and ES?L groups. In C. elegans model, the KPC-2, ES?L and community groups showed an LT50 of 9.65, 10.2 and 10.4 days, respectively. In G. mellonella model, there was no significant difference among the three groups evaluated, as observed in the bacterial fitness assay. Conclusion: This study demonstrated that the multi-drug resistant K. pneumoniae clinical isolates producing KPC-2 and ES?L were as virulent as those isolates recovered from the community, without significant loss in bacterial fitness, which contributed with their persistance in the hospital environment.
Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a virulência e o fitness bacteriano de amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC-2. Metodologia: Foram avaliados 30 isolados clínicos de K. pneumoniae distribuídos em 3 grupos distintos, KPC-2, ES?L e comunitários. A similaridade genética entre os isolados foi determinada pelas técnicas de PFGE e MLST. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado pelas técnicas de diluição em ágar e microdiluição em caldo. A pesquisa dos genes de resistência e virulência foi realizada pela técnica de PCR, seguido pelo sequenciamento dos respectivos amplicons. A caracterização das OMPs também foi avaliada pelas técnicas de PCR e sequenciamento, além do SDS-PAGE. Para avaliar a presença de hipermucoviscosidade, a formação de biofilme, a resistência ao calor, a resistência ao soro humano, a produção de hemolisina e a fagocitose por macrófagos, foram realizados testes fenotípicos in vitro. Foram utilizados os modelos de infecção em C. elegans e em G. mellonella para a avaliação do impacto dos mecanismos de virulência in vivo. O fitness bacteriano foi avaliado pela mensuração da taxa de crescimento dos isolados. Resultados: 26 padrões distintos de PFGE (A-Z) e 24 diferentes STs foram identificados entre os 30 isolados clínicos. Altas taxas de resistência aos antimicrobianos foram observadas nos grupos produtores de KPC e ES?L, inclusive à polimixina. Os genes blaKPC, blaCTX-M, blaTEM, blaSHV e blaOKP foram encontrados nestes grupos, enquanto somente os genes blaSHV e blaLEN foram detectados no grupo de isolados comunitários. Todos os isolados apresentaram alterações na OmpK36. Os genes de virulência clpK, rmpA, mrkD, fimH, kpn, ycfm, kfu, Aero1, Aero2, iutA, entB, ybtS, fyuA e traT foram detectados e sua prevalência foi uniforme entre os três grupos de isolados. O fenótipo de hipermucoviscosidade foi encontrado em somente 3 isolados, enquanto todos foram considerados resistentes aos fatores presentes no soro humano e capazes de formar biofilme. Todos os isolados carreadores do gene clpk sobreviveram ao choque térmico, com exceção do isolado A23177. Não foi detectada a produção de hemolisina em nenhum dos isolados. Diferenças significativas de suscetibilidade à fagocitose foram observadas nos grupos KPC-2 e ES?L. No modelo de C. elegans os grupos KPC-2, ES?L e comunitário apresentaram um LT50 de 9,65, 10,2 e 10,4 dias, respectivamente. No modelo de G. mellonella não houve diferença significativa entre os grupos de isolados. Não foi observada diferença significativa no fitness bacteriano dos três grupos avaliados. Conclusões: Este estudo demonstrou que isolados clínicos de K. pneumoniae produtoras de KPC-2 e ES?L, e resistentes a múltiplos antimicrobianos, são capazes de persistir no ambiente hospitalar de modo eficiente, sem a perda significativa no fitness bacterianos, além de se mostraram tão virulentos quanto os isolados provenientes da comunidade.
Descrição
Citação
VISCONDE, Marina Francisco. Avaliação dos mecanismos de virulência e do fitness bacteriano de isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae produtores de KPC-2. 2016. 184 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Translacional) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.