Quitosana e quitosanas de baixo peso molecular quimicamente sulfatadas: produção, padrão de sulfatação, comportamento hemostático e interação proteica
Data
2015-06-24
Autores
Sabry, Diego de Araujo 
Orientadores
Sassaki, Guilherme Lanzi Sassaki
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The incidence of cardiovascular diseases still is a major cause of death around the world, only in 2012 it was the causa mortis of about 17.5 million people. Currently, the main drug used against cardiovascular diseases is heparin. However, its use presents some complicating factors, such as: mechanism of action, contamination risk and obtaining costs. These factors indicate the need to search for new compounds that may replace heparin, among which the chitosan has been outstanding. The use of chitosan has attracted much attention of researchers due to its physicochemical and biological properties. In addition, its chemical modification is considerably increasing its applications in the cosmetic, food, pharmaceutical and medical industries. In this study, the commercial chitosan has been chemically modified by sulfation. The sulfated chitosan obtained by different methods have been structurally characterized, and their sulfation pattern determined by NMR spectroscopy. The sulfation method 1 (sulfuric acid:clorossulfonic acid) was the most efficient, yielding 99%, producing a chitosan sulfate (CS) consisting of glucosamine (GlcNH2) and N-acetyl-glucosamine (GlcNAc), 3,6-disulfated, with 14.2 and 85.8% of sulfate content in positions 3 and 6, respectively. Subsequently, low molecular weight chitosans (LMWC) were produced by chitosanolysis with HCI 12M, and separated by centrifugation. The LMWC were subjected to sulfation, producing supernatant sulfate (LMWC-SS), yielding 17%, and precipitate sulfate (LMWC-PS), yielding 67.3%, both composed by 2N- and 3,6-di-O-sulfate. LMWC-SSshowed 12.1, 16.5, 13.6 and 2.3% of sulfate content, respectively, in positions 2, 3, 6 of the deacetylated unit (O) and 6 of the acetylated unit (A). As for LMWC-PS, the percentage of sulfate was 13.8, 13.4 and 15.3% in the positions 2, 3 and 6, respectively. Oespite showing the same sulfation pattern, LMWC-SS and LMWC-PS have different molecular weights, 3.2 and 11.2 kOa, respectively. Both CS and LMWCS were tested for anticoagulant (aPTT, PT and TT) and antithrombotic activity. At a dose of 333.33 IJg/mL in aPTT test, whereas CS prolonged the clotting time of plasma up to 5 times, LMWC-SS and LMWC-PS prolonged 6 and 13 times, respectively. CS showed no activity at the PT test. However, LMWC-SS considerably prolonged the PT clotting time, while LMWCPS at a lower concentration, prolonged the clotting time even more. In TT test, however, only LMWC-PS acted, prolonging thrombin time more than 7 times clotting time of plasma at the dose of 26.7 IJg/mL. Assessing the antithrombotic potential in vivo, LMWC-SS does not reduce thrombus formation and CS has a moderate action. However, LMWC-PS reduced by 77% the formed thrombus, in a concentration of 10mg/kg animal. The identification of the proteins which interacted with CS and LMWCS showed that CS interacted with IgG and IgM, LMWC-SS with IgG and apolipoprotein A-li (ApoA2) and, LMWC-PS interacted with IgG, IgM, ApoA 1, ApoA2 andfibrinogen. Standingthatthe anticoagulant and antithrombotic activities of LMWCS can be both the synergistic action with ApoA 1 and 2 as by direct action on fibrinogen. These results suggest that this difference in anticoagulant mechanism of action should be related to molecular weight, as both LMWCS feature sulfate groups in the same positions.
A incidência de doenças cardiovasculares ainda é uma das principais causas de morte em todo o planeta, só no ano de 2012 foi a causa mortis de cerca de 17,5 milhões de pessoas. Atualmente, o principal fármaco no combate às doenças cardiovasculares é a heparina. Contudo, o seu uso apresenta alguns complicadores, como: mecanismo de ação, risco de contaminação e custo de obtenção. Esses fatores fazem com que haja uma busca por novos compostos que possam substituir a heparina, dentre os quais a quitosana vem se destacando. O uso da quitosana tem atraído muito a atenção de pesquisadores, devido a suas propriedades físico-químicas e biológicas. Além disso, sua modificação química vem aumentando consideravelmente suas aplicações na indústria cosmética, alimentícia, farmacêutica e médica. No presente estudo, a quitosana comercial foi modificada quimicamente por sulfatação. As quitosanas sulfatadas obtidas pelos diferentes métodos testados foram caracterizadas estruturalmente e tiveram seu padrão de sulfatação determinado por espectroscopia de RMN. O método de sulfatação 1 (ácido sulfúrico:ácido clorossulfônico) foi o mais eficiente, com rendimento de 99%, produzindo uma quitosana sulfatada (CS), composta por glucosamina (GlcNH2) e N-acetil-glucosamina (GlcNAc), 3,6- Odissulfatada, com 6,8 e 41,2% do conteúdo de sulfato nas posições 3 e 6, respectivamente. Posteriormente, quitosanas de baixo peso molecular (LMWC) foram produzidas por quitosanólise com HCI 12M e, separadas por centrifugação As LMWC foram sulfatadas, produzindo o sobrenadante sulfatado (LMWC-SS), com 17% de rendimento, e o precipitado sulfatado (LMWC-PS), com 67,3% de rendimento, ambos compostos de 2-N e 3,6-di-O-sulfato. LMWC-SS, mostrou 12,1; 16,5; 13,6 e2,3% de grupos sulfato, respectivamente nas posições 2, 3, 6 da unidade desacetilada (O) e 6 da unidade acetilada (A). Já para LMWC-PS, a porcentagem de sulfato foi de 13,8; 13,4 e15,3%, nas posições 2, 3 e 6, respectivamente. Apesar de apresentarem sulfato nas mesmas posições, LMWC-SS e LMWC-PS têm pesos moleculares diferentes, 3,2 e 11,2 kOa, respectivamente. Ambas CS e LMWCS foram testadas quanto à atividade anticoagulante (aPTT, PT e TT) e antitrombótica. Na dose de 333,33 IJg/mL no teste de aPTT, enquanto CS prolongou o tempo de coagulação do plasma em até 5 vezes, LMWC-SS e LMWC-PS prolongaram 6 e 13 vezes, respectivamente. Já para o teste de PT, CS não apresentou atividade. Contudo, LMWC-SS prolongou consideravelmente o tempo de coagulação de PT, enquanto LMWC-PS, em uma concentração menor, prolongou ainda mais o tempo de coagulação. No teste de TT apenas LMWC-PS agiu, prolongando o tempo de trombina em mais de 7 vezes o tempo de coagulação normal,na dose de 26,7 IJg/mL. A avaliação do potencial antitrombótico in vivo, mostrou que LMWC-SS não reduz a formação de trombo e CS apresenta uma ação moderada. Porém, LMWC-PS reduziu em 77% o trombo formado, na concentração de 10mg/kg de animal. A identificação das proteínas que interagiram com CS e LWMCS por nanoLC-HRMS e, subsequente análise no Mascot, mostrou que CS interagiu com IgG e IgM, LMWC-SS com IgG e apolipoproteína A-li (ApoA2) e, LMWC-PS interagiu com IgG, IgM, ApoA 1, ApoA2 e fibrinogênio. Indicando que as atividades anticoagulantes e antitrombóticas das LMWCS podem ser tanto pela ação sinérgica com ApoA 1 e 2 como por ação direta no fibrinogênio. Esses resultados sugerem que essa diferençano mecanismo deação anticoagulantedeve estar relacionada, principalmente, ao peso molecular, já que ambas LMWCS apresentam sulfato nas mesmas posições.
A incidência de doenças cardiovasculares ainda é uma das principais causas de morte em todo o planeta, só no ano de 2012 foi a causa mortis de cerca de 17,5 milhões de pessoas. Atualmente, o principal fármaco no combate às doenças cardiovasculares é a heparina. Contudo, o seu uso apresenta alguns complicadores, como: mecanismo de ação, risco de contaminação e custo de obtenção. Esses fatores fazem com que haja uma busca por novos compostos que possam substituir a heparina, dentre os quais a quitosana vem se destacando. O uso da quitosana tem atraído muito a atenção de pesquisadores, devido a suas propriedades físico-químicas e biológicas. Além disso, sua modificação química vem aumentando consideravelmente suas aplicações na indústria cosmética, alimentícia, farmacêutica e médica. No presente estudo, a quitosana comercial foi modificada quimicamente por sulfatação. As quitosanas sulfatadas obtidas pelos diferentes métodos testados foram caracterizadas estruturalmente e tiveram seu padrão de sulfatação determinado por espectroscopia de RMN. O método de sulfatação 1 (ácido sulfúrico:ácido clorossulfônico) foi o mais eficiente, com rendimento de 99%, produzindo uma quitosana sulfatada (CS), composta por glucosamina (GlcNH2) e N-acetil-glucosamina (GlcNAc), 3,6- Odissulfatada, com 6,8 e 41,2% do conteúdo de sulfato nas posições 3 e 6, respectivamente. Posteriormente, quitosanas de baixo peso molecular (LMWC) foram produzidas por quitosanólise com HCI 12M e, separadas por centrifugação As LMWC foram sulfatadas, produzindo o sobrenadante sulfatado (LMWC-SS), com 17% de rendimento, e o precipitado sulfatado (LMWC-PS), com 67,3% de rendimento, ambos compostos de 2-N e 3,6-di-O-sulfato. LMWC-SS, mostrou 12,1; 16,5; 13,6 e2,3% de grupos sulfato, respectivamente nas posições 2, 3, 6 da unidade desacetilada (O) e 6 da unidade acetilada (A). Já para LMWC-PS, a porcentagem de sulfato foi de 13,8; 13,4 e15,3%, nas posições 2, 3 e 6, respectivamente. Apesar de apresentarem sulfato nas mesmas posições, LMWC-SS e LMWC-PS têm pesos moleculares diferentes, 3,2 e 11,2 kOa, respectivamente. Ambas CS e LMWCS foram testadas quanto à atividade anticoagulante (aPTT, PT e TT) e antitrombótica. Na dose de 333,33 IJg/mL no teste de aPTT, enquanto CS prolongou o tempo de coagulação do plasma em até 5 vezes, LMWC-SS e LMWC-PS prolongaram 6 e 13 vezes, respectivamente. Já para o teste de PT, CS não apresentou atividade. Contudo, LMWC-SS prolongou consideravelmente o tempo de coagulação de PT, enquanto LMWC-PS, em uma concentração menor, prolongou ainda mais o tempo de coagulação. No teste de TT apenas LMWC-PS agiu, prolongando o tempo de trombina em mais de 7 vezes o tempo de coagulação normal,na dose de 26,7 IJg/mL. A avaliação do potencial antitrombótico in vivo, mostrou que LMWC-SS não reduz a formação de trombo e CS apresenta uma ação moderada. Porém, LMWC-PS reduziu em 77% o trombo formado, na concentração de 10mg/kg de animal. A identificação das proteínas que interagiram com CS e LWMCS por nanoLC-HRMS e, subsequente análise no Mascot, mostrou que CS interagiu com IgG e IgM, LMWC-SS com IgG e apolipoproteína A-li (ApoA2) e, LMWC-PS interagiu com IgG, IgM, ApoA 1, ApoA2 e fibrinogênio. Indicando que as atividades anticoagulantes e antitrombóticas das LMWCS podem ser tanto pela ação sinérgica com ApoA 1 e 2 como por ação direta no fibrinogênio. Esses resultados sugerem que essa diferençano mecanismo deação anticoagulantedeve estar relacionada, principalmente, ao peso molecular, já que ambas LMWCS apresentam sulfato nas mesmas posições.
Descrição
Citação
SABRY, Diego de Araujo. Quitosana e quitosanas de baixo peso molecular quimicamente sulfatadas: produção, padrão de sulfatação, comportamento hemostático e interação proteica. 2015. 70 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.