Estudo comparativo de protocolos de imunização gênica: eletroporação aumenta consistentemente a resposta imune humoral
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Data
2008-03-26
Autores
Parise, Carolina Bellini 
Orientadores
Han, Sang Won
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Gene immunization may bypass some difficulties found with protein immunogen, such as the obtainment of purified antigen and the immune response reactivity to its native conformation. Thus, antigen encoding DNA inserted into a vector is inoculated into animal and the protein expressed in vivo with the appropriate three-dimensional structure stimulates the production of specific antibodies. However, the gene immunization methods may determine the efficacy of DNA vaccine. The present study compared four protocols of DNA immunization, using three different antigens: two of them phylogenetically conservative, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) and human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), and other from vegetal origin, Kunitz-type serine protease inhibitor from Bauhinia bauhinioides (BbKi). For this, Balb/c mice were immunized with plasmid DNA encoding hVEGF165, hFGF-2 or BbKi genes. In the first protocol, animals were immunized by intrasplenic (i.s.) pathway; in the second, intramuscularly (i.m.); in the third, i.m. injections were followed by electroporation (ep); and in the fourth, i.m. injections followed by ep were performed in animals pre-immunized with antigen-transfected cells. Sera were analyzed by ELISA to detect the presence of anti-hVEGF165, -hFGF-2 or -BbKi antibodies. Results showed that i.s. immunization did not elicit detectable humoral immune response in our conditions. On the other hand, statistical analyses revealed that the ep improved the immune response to i.m. immunization and that three DNA immunizations followed by ep elicited the same effect obtained by two i.m. immunizations followed by ep in pre-immunized animals with antigentransfected cells. Our results showed that all protocols worked similarly for the three studied antigens and that i.m. gene immunization followed by ep was the more advantageous protocol. In addition, the immune response to i.m. immunization followed by ep was comparable to that obtained by protein immunization. Finally, these data allowed us select an efficient DNA immunization protocol that makes possible the antibody obtainment in the lack of purified protein.
A imunização gênica pode contornar alguns problemas encontrados na imunização protéica, quais sejam as dificuldades na obtenção do antígeno purificado e a reatividade da resposta imune (r.i.) com a forma nativa do antígeno. O gene que codifica o antígeno de interesse, carregado por um vetor, é injetado no animal e a proteína é expressa in vivo, com a estrutura tridimensional apropriada, favorecendo a produção de anticorpos específicos. Entretanto, o esquema de imunização gênica pode determinar a eficácia da vacina de DNA. No presente estudo, comparamos quatro protocolos de imunização gênica, usando três antígenos diferentes: dois deles guardam grande homologia na escala filogenética, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) e human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), e um de origem vegetal, o inibidor de serina protease extraído de Bauhinia bauhinioides (BbKi). Para tanto, grupos de camundongos Balb/c foram imunizados com DNA plasmideal carregando o gene hVEGF165, hFGF-2 ou BbKi. No primeiro protocolo, imunizamos os animais via intraesplênica (i.s.); no segundo, via intramuscular (i.m.); no terceiro, via i.m. seguida de eletroporação (ep); e no quarto, via i.m. seguida de ep em animais préimunizados com células modificadas para expressar os respectivos antígenos. Soros de animais imunizados foram analisados por ELISA para detecção da presença de anticorpos anti-hVEGF165, anti-hFGF-2 ou anti-BbKi. Os resultados mostraram que a imunização i.s. não provocou r.i. humoral detectável em nossas condições. Por outro lado, análises estatísticas indicaram que a ep melhorou muito a r.i. à imunização i.m. e que três imunizações gênicas seguidas de ep produzem o mesmo efeito que duas da mesma forma em animais pré-imunizados com células transfectadas para expressar o antígeno correspondente. Nossos resultados mostraram que todos os protocolos funcionaram de maneira similar para os três antígenos estudados e que a imunização gênica via i.m. seguida de ep foi o esquema de imunização mais vantajoso. Ainda, a r.i. à imunização i.m. seguida de ep foi comparável à obtida por imunização protéica no caso da proteína vegetal. Finalmente, esses achados permitiram selecionar um protocolo eficiente de imunização gênica que torna possível a obtenção de anticorpos na falta da proteína purificada.
A imunização gênica pode contornar alguns problemas encontrados na imunização protéica, quais sejam as dificuldades na obtenção do antígeno purificado e a reatividade da resposta imune (r.i.) com a forma nativa do antígeno. O gene que codifica o antígeno de interesse, carregado por um vetor, é injetado no animal e a proteína é expressa in vivo, com a estrutura tridimensional apropriada, favorecendo a produção de anticorpos específicos. Entretanto, o esquema de imunização gênica pode determinar a eficácia da vacina de DNA. No presente estudo, comparamos quatro protocolos de imunização gênica, usando três antígenos diferentes: dois deles guardam grande homologia na escala filogenética, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) e human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), e um de origem vegetal, o inibidor de serina protease extraído de Bauhinia bauhinioides (BbKi). Para tanto, grupos de camundongos Balb/c foram imunizados com DNA plasmideal carregando o gene hVEGF165, hFGF-2 ou BbKi. No primeiro protocolo, imunizamos os animais via intraesplênica (i.s.); no segundo, via intramuscular (i.m.); no terceiro, via i.m. seguida de eletroporação (ep); e no quarto, via i.m. seguida de ep em animais préimunizados com células modificadas para expressar os respectivos antígenos. Soros de animais imunizados foram analisados por ELISA para detecção da presença de anticorpos anti-hVEGF165, anti-hFGF-2 ou anti-BbKi. Os resultados mostraram que a imunização i.s. não provocou r.i. humoral detectável em nossas condições. Por outro lado, análises estatísticas indicaram que a ep melhorou muito a r.i. à imunização i.m. e que três imunizações gênicas seguidas de ep produzem o mesmo efeito que duas da mesma forma em animais pré-imunizados com células transfectadas para expressar o antígeno correspondente. Nossos resultados mostraram que todos os protocolos funcionaram de maneira similar para os três antígenos estudados e que a imunização gênica via i.m. seguida de ep foi o esquema de imunização mais vantajoso. Ainda, a r.i. à imunização i.m. seguida de ep foi comparável à obtida por imunização protéica no caso da proteína vegetal. Finalmente, esses achados permitiram selecionar um protocolo eficiente de imunização gênica que torna possível a obtenção de anticorpos na falta da proteína purificada.
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Citação
PARISE, Carolina Bellini. Estudo comparativo de protocolos de imunização gênica: eletroporação aumenta consistentemente a resposta imune humoral. 2008. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2008.