Melanoma acral lentiginoso: análise imuno-histoquímica da expressão das proteínas scf, kit, braf, ciclina d1, myc, pten e avaliação por hibridização in situ por fluorescência (fish) do gene pten (10q23)
Data
2014-12-03
Autores
Carapeto, Fernando Cintra Lopes 
Orientadores
Landman, Gilles Landman
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Melanomas are malignant neoplasms that arise from skin melanocytes, the clinical and histopatological features of the acral lentiginous melanoma are different from other melanoma types. It is less prevalent in caucasian and more frequent in asian, spanish and african descents. Occurring at the extremities, areas not exposed to ultraviolet radiation, such as palms, soles and subungual region, with high mortality and short survival, although of low incidence. The technique of tissue microarray allows the assessment of various tissue samples simultaneously, along with analysis of a wide variety of biological markers in the same experiment. A combining analysis study of the expression of cell proliferation, apoptosis and the use of tissue microarray technique would be useful for understanding the initiation and progression of acral lentiginous melanoma. Objective: To evaluate the expression of proteins and study gene related to the pathogenesis of acral-lentiginous melanoma. Specific objectives: 1) To evaluate the immunohistochemical expression of SCF, KIT, BRAF, CYCLIN D1, MYC, PTEN proteins, 2) measure changes in the gene PTEN (10q23) by the FISH technique in acral melanoma, 3) Correlate the proteins expression evaluated by immunohistochemistry with the changes of the gene studied, 4) Correlate the expression of proteins by immunohistochemistry and evaluated the changes of the gene studied with pathological, clinical, demographic and follow up data. Patients and Methods: Retrospective data from patients with cutaneous melanoma of the acral lentiginous type, greater than or equal to 1.0 mm, held at the Escola Paulista de Medicina. It has been used paraffin blocks of primary tumor archived at the Departamento de Patologia and demographic, clinical and follow-up data obtained from medical records of these patients. From these samples, slides were prepared by the tissue microarray technique, used for evaluation of protein expression of SCF, KIT, BRAF, CYCLIN D1, MYC, PTEN, immunohistochemistry; changes in the PTEN gene (10q23) in samples of acral lentiginous-FISH. Results: Cases from 2006 to 2010 were reviewed of 49 patients with acral lentiginous melanoma, 24 were female (48.97 %) and 25 males (51.03 %) with mean age at diagnosis of 60 , 94 years (16-82 years) . The primary tumor was located in the foot in 44 patients (89.8 %) and hands in 5 patients (10.2 %) . Regarding ethnicity , 30.6 % were white (15 patients ) , 34.7 % was African descent (17 patients) , 4.1% were registered as non-white (2 patients) and 15 patients (30.61 %) had no information Dos 49 melanomas studied , all showed vertical growth , 63.26 % contained ulceration (31 cases), the mean mitotic index was 3.37 mitoses/mm2, ranging from 0 to 22.5 mitoses/mm2 ; Breslow depth averaged of 6.95 mm , ranging from 1.2 to 30.0 mm and the mean level was Clark IV , ranging from III to V; correlation of malignancy with positivity and heterogeneity of expression of SCF was significant at p = 0.001 , p < and 0.000 respectively for positive KIT p = 0.005, p = 0.003 heterogeneity , MYC positive p <0.000 ; heterogeneity p < 0.000, p = 0.005 PTEN positive ; heterogeneity p <0.000 . The positivity of BRAF and cyclin D1 were not significant p = 0.053 , p = 0.259 respectively ; heterogeneity p < 0.000 , p = 0.024 are significant for the PTEN gene was taken to analysis of fluorescent in situ hybridization however due to pre analytical problems examination could not be conducted on various samples. The correlation between the change in the number of copies and the malignancy was not significant at p = 0.798 by Mann-Whitney test. The correlations of data metastasis, positivity and heterogeneity are not significant for any of the markers. Discussion: There was equal distribution according to gender (women: 48.98 % and male: 51.02 %). Regarding ethnicity , were found and there was no eastern low number of african descent , although the sum of these browns resulted in most patients (55.8 %) in agreement with that reported by Bradford (Bradford et al . , 2009) . Histopathological parameters mentioned above reflect a delayed diagnosis , resulting in a worse prognosis due to the advanced stage of the disease ( Balch et al . , 2009) . In this work , we tried to minimize subjectivity in the analysis of immunohistochemical expression of the proteins studied , differing national and international publications , which define a predetermined percentage of positive cells as well as intensity of semi -quantitative labeling ( Hoos et al . , 2001; Sviatoha et al , 2002; . Pacifico et al , 2004; . Ohsie et al , 2008; . Torres - Cabala et al , 2009; . Bai et al , 2012; . Park et al , 2012; . Long et al . , 2013 ) based on the results obtained associations of positive staining and heterogeneity pairs, resulting in a high discrimination power were made . Top 5 reasons chance of the sample to be malignant if the markers are positive are: BRAF - MYC ( 78.2 ) , PTEN - MYC ( 37,14 ) , SCF- MYC ( 30 ) , BRAF -SCF ( 27.3 ) , KIT -SCF ( 18 ) , and express markers heterogeneity BRAF - MYC ( 95,33 ) , SCF- MYC ( 43,31 ) , BRAF -SCF ( 33,58 ) , PTEN - MYC (31,25 ) , KIT -SCF ( 18,31 ) the results indicate that the heterogeneity of immunohistochemical expression has greater diagnostic potential comparing to the sheer positivity of markers . This approach seems not to have been used for this purpose in melanomas. The theory and observation of intratumoral heterogeneity and intertumoral emerged after the study of resistance to target specific therapies ( Wilmott et al , 2012; . . Yancovitz et al , 2012) and is still not accepted by the entire scientific community but this situation is changing . despite these associations need to be proven with a larger cohort , double-blind study and the inclusion of neighboring samples to be confirmed , our findings are very promising and pioneering. Conclusions: The heterogeneity has greater discriminatory power than the positivity of the markers and the interaction of the protein markers BRAF - MYC stand out too much in either regard.
Introdução. O melanoma é uma neoplasia maligna originada dos melanócitos cutâneos com diversas classificações. O melanoma tipo acral lentiginoso apresenta características clínicas e histopatológicas diferentes dos demais tipos de melanomas, com prevalência menor na população caucasiana e maior em asiáticos, hispânicos e afrodescendentes. Anatomicamente, acomete extremidades, áreas não expostas à radiação ultravioleta como palma das mãos, planta dos pés e região subungueal, tem altos índices de letalidade e sobrevida curta, embora de incidência baixa. A técnica de tissue microarray permite a avaliação de diversas amostras teciduais simultaneamente, além da análise de grande variedade de marcadores biológicos em um mesmo experimento. Um estudo combinando a análise da expressão de fatores de proliferação celular, apoptose e a utilização da técnica de tissue microarray seria de grande utilidade para o entendimento do início e progressão do melanoma acral lentiginoso. Objetivo: Avaliar a expressão de proteínas e estudar genes relacionados à patogênese do melanoma acral lentiginoso. Objetivos específicos: 1) Avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas SCF, KIT, BRAF, CICLINA D1, MYC, PTEN, 2) Avaliar as alterações no gene PTEN (10q23) pela técnica de FISH, 3) Correlacionar a expressão das proteínas avaliadas por imuno-histoquímica com as alterações do gene estudado, 4) Correlacionar a expressão das proteínas avaliadas por imuno-histoquímica e as alterações do gene estudado com dados anatomopatológicos, clínicos, demográficos e de seguimento. Pacientes e métodos: Estudo retrospectivo com dados de pacientes com diagnóstico histopatológico de melanoma cutâneo do tipo acral lentiginoso, maior ou igual a 1,0 mm, realizado na Escola Paulista de Medicina. Foram utilizados blocos de parafina do tumor primário arquivados no Departamento de Anatomia Patológica e os dados demográficos, clínicos e de seguimento foram obtidos dos prontuários destes pacientes. A partir destas amostras, foram preparadas lâminas pela técnica de tissue microarray, utilizadas para avaliação de: expressão das proteínas SCF, KIT, BRAF, CICLINA D1, MYC, PTEN, por imuno-histoquímica; alterações no gene PTEN (10q23) em amostras de melanoma acral lentiginoso por FISH. Resultados:.Foram revisado casos de 2006 a 2010 dos 49 pacientes com melanoma acral lentiginoso, 24 eram do sexo feminino (48,97%) e 25 do sexo masculino (51,03%), com média de idade ao diagnóstico de 60,94 anos, (16 - 82 anos). O tumor primário localizou-se nos pés em 44 pacientes (89,8%) e nas mãos em 5 pacientes (10,2 %). Quanto à etnia, 30,6% era branca (15 pacientes), 34,7% era afrodescendente (17 pacientes), 4,1 % foram registrados como não brancos (2 pacientes) e 15 pacientes (30.61%) não possuíam informação Dos 49 melanomas estudados, todos apresentaram crescimento vertical, 63,26% continham ulceração (31 casos); o índice mitótico médio foi de 3,37 mitoses/mm2, variando de 0 a 22,5 mitoses/mm2; a profundidade de Breslow média foi de 6,95mm, variando de 1,2 a 30,0 mm e a média dos níveis de Clark foi de IV, variando de III a V A correlação de malignidade com a positividade e heterogeneidade de expressão de SCF foi significativa p=0,001; p<0,000 respectivamente bem como para KIT positividade p=0,005; heterogeneidade p=0,003, MYC positividade p<0,000; heterogeneidade p<0,000; PTEN positividade p=0,005; heterogeneidade p<0,000. A positividade de BRAF e CICLINA D1 não foram significativas p=0,053, p=0,259 respectivamente; porem a heterogeneidade p<0,000, p=0,024 são significativas Para o gene PTEN foi feita a analise de hibridização in situ fluorescente contudo devido a problemas pré analíticos o exame não pode ser realizado em diversas amostras. a correlação entre a alteração do número de copias e a malignidade não é significativa p =0,798 pelo teste de Mann-Whitney. As correlações dos dados de metástase, positividade e heterogeneidade não são significativos para nenhum dos marcadores. Discussão: Houve distribuição equitativa quanto ao gênero (mulheres: 48,98%, homens: 51,02%). Em relação à etnia, não foram encontrados orientais e houve baixo número de afro-descendentes, embora a soma destes aos pardos resultou em maioria dos pacientes (55,8%) concordando com o relatado por Bradford (Bradford et al., 2009). Os parâmetros histopatológicos mencionados anteriormente refletem um diagnóstico tardio, resultando em pior prognóstico, devido ao estádio avançado da doença (Balch et al., 2009). Neste trabalho, procuramos minimizar a subjetividade na análise da expressão imuno-histoquímica das proteínas estudadas, diferindo das publicações nacionais e internacionais, que definem uma porcentagem pré-estabelecida de células positivas, assim como de intensidade de marcação semi-quantitativa (Hoos et al., 2001; Sviatoha et al., 2002; Pacifico et al., 2004; Ohsie et al., 2008; Torres-Cabala et al., 2009; Bai et al., 2012; Park et al., 2012; Long et al., 2013) Com base nos resultados obtidos foram feitas associações de marcação positiva e de heterogeneidade dois a dois, que resultaram em um alto poder de discriminação. As 5 maiores razões de chance da amostra ser maligna se os marcadores forem positivos são: BRAF-MYC (78,2), PTEN-MYC (37,14), SCF-MYC (30), BRAF-SCF (27,3), KIT-SCF (18), e se os marcadores expressarem heterogeneidade BRAF-MYC (95,33), SCF-MYC (43,31), BRAF-SCF (33,58), PTEN-MYC (31,25), KIT-SCF (18,31) Os resultados indicam que a heterogeneidade de expressão imuno-histoquímica tem maior potencial diagnóstico comparando-se com a positividade pura e simples dos marcadores. Esta abordagem não parece ter sido usada para tal propósito em melanomas. A teoria e observação da heterogeneidade intratumoral e intertumoral surgiu após o estudo da resistência as terapias alvo especificas (Wilmott et al., 2012; Yancovitz et al., 2012) e ainda não é aceita por toda a comunidade cientifica mas esse panorama vem mudando.Apesar destas associações precisarem ser comprovados com uma coorte maior, estudo duplo-cego e a inclusão de amostras limítrofes para serem confirmados, os resultados aqui obtidos são muito promissores e pioneiros. Conclusões: A heterogeneidade tem maior poder discriminatório do que a positividade dos marcadores e a interação dos marcadores de proteína BRAF-MYC se destacam muito em ambos os quesito.
Introdução. O melanoma é uma neoplasia maligna originada dos melanócitos cutâneos com diversas classificações. O melanoma tipo acral lentiginoso apresenta características clínicas e histopatológicas diferentes dos demais tipos de melanomas, com prevalência menor na população caucasiana e maior em asiáticos, hispânicos e afrodescendentes. Anatomicamente, acomete extremidades, áreas não expostas à radiação ultravioleta como palma das mãos, planta dos pés e região subungueal, tem altos índices de letalidade e sobrevida curta, embora de incidência baixa. A técnica de tissue microarray permite a avaliação de diversas amostras teciduais simultaneamente, além da análise de grande variedade de marcadores biológicos em um mesmo experimento. Um estudo combinando a análise da expressão de fatores de proliferação celular, apoptose e a utilização da técnica de tissue microarray seria de grande utilidade para o entendimento do início e progressão do melanoma acral lentiginoso. Objetivo: Avaliar a expressão de proteínas e estudar genes relacionados à patogênese do melanoma acral lentiginoso. Objetivos específicos: 1) Avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas SCF, KIT, BRAF, CICLINA D1, MYC, PTEN, 2) Avaliar as alterações no gene PTEN (10q23) pela técnica de FISH, 3) Correlacionar a expressão das proteínas avaliadas por imuno-histoquímica com as alterações do gene estudado, 4) Correlacionar a expressão das proteínas avaliadas por imuno-histoquímica e as alterações do gene estudado com dados anatomopatológicos, clínicos, demográficos e de seguimento. Pacientes e métodos: Estudo retrospectivo com dados de pacientes com diagnóstico histopatológico de melanoma cutâneo do tipo acral lentiginoso, maior ou igual a 1,0 mm, realizado na Escola Paulista de Medicina. Foram utilizados blocos de parafina do tumor primário arquivados no Departamento de Anatomia Patológica e os dados demográficos, clínicos e de seguimento foram obtidos dos prontuários destes pacientes. A partir destas amostras, foram preparadas lâminas pela técnica de tissue microarray, utilizadas para avaliação de: expressão das proteínas SCF, KIT, BRAF, CICLINA D1, MYC, PTEN, por imuno-histoquímica; alterações no gene PTEN (10q23) em amostras de melanoma acral lentiginoso por FISH. Resultados:.Foram revisado casos de 2006 a 2010 dos 49 pacientes com melanoma acral lentiginoso, 24 eram do sexo feminino (48,97%) e 25 do sexo masculino (51,03%), com média de idade ao diagnóstico de 60,94 anos, (16 - 82 anos). O tumor primário localizou-se nos pés em 44 pacientes (89,8%) e nas mãos em 5 pacientes (10,2 %). Quanto à etnia, 30,6% era branca (15 pacientes), 34,7% era afrodescendente (17 pacientes), 4,1 % foram registrados como não brancos (2 pacientes) e 15 pacientes (30.61%) não possuíam informação Dos 49 melanomas estudados, todos apresentaram crescimento vertical, 63,26% continham ulceração (31 casos); o índice mitótico médio foi de 3,37 mitoses/mm2, variando de 0 a 22,5 mitoses/mm2; a profundidade de Breslow média foi de 6,95mm, variando de 1,2 a 30,0 mm e a média dos níveis de Clark foi de IV, variando de III a V A correlação de malignidade com a positividade e heterogeneidade de expressão de SCF foi significativa p=0,001; p<0,000 respectivamente bem como para KIT positividade p=0,005; heterogeneidade p=0,003, MYC positividade p<0,000; heterogeneidade p<0,000; PTEN positividade p=0,005; heterogeneidade p<0,000. A positividade de BRAF e CICLINA D1 não foram significativas p=0,053, p=0,259 respectivamente; porem a heterogeneidade p<0,000, p=0,024 são significativas Para o gene PTEN foi feita a analise de hibridização in situ fluorescente contudo devido a problemas pré analíticos o exame não pode ser realizado em diversas amostras. a correlação entre a alteração do número de copias e a malignidade não é significativa p =0,798 pelo teste de Mann-Whitney. As correlações dos dados de metástase, positividade e heterogeneidade não são significativos para nenhum dos marcadores. Discussão: Houve distribuição equitativa quanto ao gênero (mulheres: 48,98%, homens: 51,02%). Em relação à etnia, não foram encontrados orientais e houve baixo número de afro-descendentes, embora a soma destes aos pardos resultou em maioria dos pacientes (55,8%) concordando com o relatado por Bradford (Bradford et al., 2009). Os parâmetros histopatológicos mencionados anteriormente refletem um diagnóstico tardio, resultando em pior prognóstico, devido ao estádio avançado da doença (Balch et al., 2009). Neste trabalho, procuramos minimizar a subjetividade na análise da expressão imuno-histoquímica das proteínas estudadas, diferindo das publicações nacionais e internacionais, que definem uma porcentagem pré-estabelecida de células positivas, assim como de intensidade de marcação semi-quantitativa (Hoos et al., 2001; Sviatoha et al., 2002; Pacifico et al., 2004; Ohsie et al., 2008; Torres-Cabala et al., 2009; Bai et al., 2012; Park et al., 2012; Long et al., 2013) Com base nos resultados obtidos foram feitas associações de marcação positiva e de heterogeneidade dois a dois, que resultaram em um alto poder de discriminação. As 5 maiores razões de chance da amostra ser maligna se os marcadores forem positivos são: BRAF-MYC (78,2), PTEN-MYC (37,14), SCF-MYC (30), BRAF-SCF (27,3), KIT-SCF (18), e se os marcadores expressarem heterogeneidade BRAF-MYC (95,33), SCF-MYC (43,31), BRAF-SCF (33,58), PTEN-MYC (31,25), KIT-SCF (18,31) Os resultados indicam que a heterogeneidade de expressão imuno-histoquímica tem maior potencial diagnóstico comparando-se com a positividade pura e simples dos marcadores. Esta abordagem não parece ter sido usada para tal propósito em melanomas. A teoria e observação da heterogeneidade intratumoral e intertumoral surgiu após o estudo da resistência as terapias alvo especificas (Wilmott et al., 2012; Yancovitz et al., 2012) e ainda não é aceita por toda a comunidade cientifica mas esse panorama vem mudando.Apesar destas associações precisarem ser comprovados com uma coorte maior, estudo duplo-cego e a inclusão de amostras limítrofes para serem confirmados, os resultados aqui obtidos são muito promissores e pioneiros. Conclusões: A heterogeneidade tem maior poder discriminatório do que a positividade dos marcadores e a interação dos marcadores de proteína BRAF-MYC se destacam muito em ambos os quesito.
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Citação
CARAPETO, Fernando Cintra Lopes. Melanoma acral lentiginoso: análise imuno-histoquímica da expressão das proteínas scf, kit, braf, ciclina d1, myc, pten e avaliação por hibridização in situ por fluorescência (fish) do gene pten (10q23). 2014. 122 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.