Construção de uma biblioteca de inibidores de proteases em sistema phage display e seleção de inibidores específicos para proteases digestivas de larvas de Aedes aegypti
Data
2012
Autores
Soares, Tatiane Sanches 
Orientadores
Tanaka, Aparecida Sadae
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
A dengue e uma doenca grave transmitida pelo mosquito Aedes aegypti durante a alimentacao. E estimado que o virus da dengue seja transmitido a milhoes de pessoas a cada ano nas areas tropicais e subtropicais. Estrategias de controle de dengue tem sido baseadas no controle do vetor, o Aedes aegypti, usando inseticidas, mas o surgimento de linhagens de mosquitos resistentes impoe novos desafios. O objetivo deste trabalho foi identificar inibidores especificos para as enzimas digestivas de larvas de Aedes aegypti, os quais poderao servir como alvos alternativos no controle deste inseto no futuro. Inibidores de proteases de alta afinidade foram selecionados para as enzimas digestivas do intestino medio de larvas de 4º instar, indicando as especificidades dessas enzimas. Estes inibidores foram obtidos de uma biblioteca de fagos contendo mutantes de HiTI, um inibidor de tripsina da mosca Haematobia irritans, mutado no loop reativo (P1-P4Æ). Baseado nas sequencias de aminoacidos selecionadas, sete mutantes do inibidor HiTI foram clonados, expressos e purificados. Os resultados mostraram que os mutantes de HiTI nomeados T6 (RGGAV) e T128 (WNEGL) foram selecionados para as enzimas do tipo tripsina (IC50 1,1 nM) e do tipo quimotripsina (IC50 11,6 nM) de larvas, respectivamente. Os variantes T23 (LLGGL) e T149 (GGVWR) inibiram enzimas do tipo quimotripsina (IC50 4,2 nM e 29,0 nM, respectivamente) e do tipo elastase (ambas IC50 de 1,2 nM). Devido ao baixo rendimento obtido dos mutantes de HiTI purificados, as sequencias da regiao contendo as posicoes P1-P4Æ dos mutantes T6, T23 e T149 foram inseridas em outro inibidor Kunitz, o dominio 1 do inibidor boophilina. Os mutantes T6/D1, T23/D1 e T149/D1 em dominio D1 da boophilina purificados apresentaram atividade larvicida contra larvas de 4° instar de Ae. aegypti. Em conclusao, neste trabalho pela primeira vez foram obtidos inibidores especificos para as enzimas digestivas de larvas de 4º instar de Ae. aegypti por sistema phage display. Nossos dados sugerem fortemente a presenca de enzimas do tipo elastase em larvas de Ae. aegypti. Os variantes T6, T23 e T149 serao utilizados em estudos futuros para o desenvolvimento de inibidores sinteticos para as enzimas de larvas a fim de se obter um larvicida para o controle do vetor
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2012. 85 p.