Atuação das polimerases de síntese translesão κ e ι na replicação e sobrevivência de células com danos no genoma

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Data
2023-11-06
Autores
Ariwoola, Abu-Bakr Adetayo [UNIFESP]
Orientadores
Menck, Carlos Frederico Martins [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
A molécula de DNA é constantemente exposta a agentes que geram diferentes tipos de lesões, sejam esses de origem endógena ou exógena. Porém, como resposta a esses danos as células desenvolveram uma rede de vias moleculares cuja função é o reparo das lesões presentes no genoma. A presença de lesões durante a replicação do DNA pode levar a paradas e colapsos das forquilhas de replicação, gerando quebras, desencadeando processos mutagênicos e carcinogênicos ou a morte celular. Porém, esse cenário é evitado pela presença de DNA polimerases especializadas, capazes de sintetizar DNA através das lesões, em um processo denominado Síntese Translesão (TLS). Após diversos avanços na pesquisa sobre essas polimerases, sabe-se hoje que sua atuação vai além da TLS, pois essas enzimas atuam também em diversas outras vias, como vias de reparo e replicação. Apesar dos avanços, pouco se sabe das outras funções dessas proteínas nas células humanas. Assim, no presente trabalho avaliamos os diferentes mecanismos de atuação de duas TLS polimerases da família Y a Polκ e na Polι, replicação e sobrevivência de células humanas tumorais contendo danos no genoma causados por dois agentes citotóxicos diferentes, a amplamente estudada luz UVC e o quimioterápico cisplatina, muito utilizado no combate à diferentes tipos de tumores. Para isso, utilizamos células de Glioblastoma Multiforme humano (GBM) nocaute para Polκ (U251MG Polκ), Polι (U251MG Polι) e selvagem (U251MG WT), editadas e validadas em outro trabalho por membros do nosso grupo de pesquisa. Nossos resultados por ensaio de viabilidade celular por colorimetria (XTT) não indicaram diferenças na sensibilidade causada por UVC entre as linhagens testadas, sendo que esse resultado se manteve mesmo quando foi feita a inibição da via ATR/Chk1. Já no ensaio clonogênico, ambas as linhagens nocautes foram mais sensíveis a UVC, sendo a principal diferença observada entre as células deficientes Polι e as WT. Observamos efeito da irradiação no ciclo celular apenas na linhagem deficiente em Polκ. Além disso, quantificamos via reativação por célula hospedeira (HCR) a capacidade de reparo e remoção de lesões causadas por UVC e observamos que a ausência de Polκ impactou a capacidade das células de GBM em remover essas lesões. A seguir, avaliamos a resposta dessas células frente a lesões induzidas pelo quimioterápico cisplatina. Nossos resultados de viabilidade celular indicaram que as células nocautes foram mais sensíveis quando comparadas com a linhagem selvagem. Vale ressaltar que as células deficientes em Polι apresentaram a maior sensibilidade em todas as condições analisadas. Resultados similares foram observados para a sobrevivência clonogênica. Vimos também que, quando comparadas com as células WT, a ausência das TLS polimerases inibiu a passagem das células de GBM pelas fases S/G2-M e diminuiu gravemente a capacidade de migração, cicatrização após o tratamento com o quimioterápico. Por fim, realizamos o ensaio de fibra de DNA e observamos maior parada das forquilhas de replicação na ausência de Polκ. Nesse mesmo experimento, observamos que, apesar de cisplatina não provocar paradas nas células selvagem, as duas linhagens de células nocautes apresentavam paradas em resposta ao tratamento. Em conclusão, os resultados obtidos indicaram de diversas formas que a presença das polimerases de TLS protege as células de GBM contra a citotoxicidade causada por cisplatina, mas seus efeitos na resposta à UVC não foram completamente claros. Dessa forma, é necessário que mais estudos sejam realizados com ambos os agentes nesse cenário.
Descrição
Citação
ARIWOOLA, Abu-Bakr Adetayo. Atuação das polimerases de síntese translesão κ e ι na replicação e sobrevivência de células com danos no genoma. 2023. 74 f. Dissertação (Mestrado em Hematologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2023.