Localização, função e regulação de receptores muscarínicos em dúctulos eferentes e epidídimo de ratos
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Date
2006-02-22
Authors
Siu, Erica Rosanna [UNIFESP]
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Porto, Catarina Segreti [UNIFESP]
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Dissertação de mestrado
Journal Title
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Volume Title
Abstract
The presence of muscarinic acetylcholine receptors has been shown in the epididymis from 50 day-old rats by molecular, functional and radioligand binding assays performed in our laboratory. Considering that a variety of cell types with different functions is present in the epithelium of these tissues, we proposed to study the localization, function and regulation of these receptors. The localization of M1, M2 and M3 muscarinic receptor subtypes in the efferent ductules and epididymis was determined by immunohistochemical assays. A variable degree of immunostaining was detected for each muscarinic receptor subtype depending on the cell type and tissue analysed. M1 receptor subtype was detected over ciliated and non ciliated cells of the efferent ductules, while M2 and M3 were observed in the apical region of the ciliated cells. Apical and narrow cells of the initial segment showed a distinct staining for M1 antibody, whereas a supranuclear reaction was noted in principal cells of the caput of the epididymis. In addition, staining for M1, M2 and M3 receptor subtypes was visible in the apical region of some principal cells of the proximal and distal cauda. M3 receptor subtype was detected in the peritubular smooth muscle of efferent ductules and all epididymal regions, consistent with previous functional studies that suggested the involvement of this subtype in the cauda epididymal tubule contraction. The involvement of the cholinergic system in secretory processes has been shown in several tissues. The present study showed the modulation of protein synthesis and/or secretion by stimulating muscarinic acetylcholine receptors in the efferent ductules and epididymis from 50 day-old rats by using [35S]-Methionine total incorporation in vitro studies. Carbachol induced a significant increase in [35S]-Methionine incorporation in proteins secreted by efferent ductules and in secreted and tissular proteins of caput of the epididymis, when compared to their respective basal values (absence of carbachol). These effects were abolished by atropine. The regulation of muscarinic receptors expression in the epididymis by testicular factors was determined by using rats after bilateral efferent ductules ligation (10 days). The efficacy of efferent ductules ligation was evaluated by histo-morphological analysis, the monitoring of body weight and reproductive tract organs relative weight, and plasma and tissular testosterone measurement of control, sham-operated and efferent ductules ligated rats. The alterations detected by histo-morphological analysis and tissue relative weight were consistent with those described in the literature. Moreover, the plasma testosterone levels of efferent ductules ligated rats were similar to that observed in control animals. On the other hand, tissular testosterone levels differed depending on the epididymal region analysed and efferent ductules ligation. After efferent ductules ligation there was a decrease in the testosterone levels observed in the caput of the epididymis, when compared to control and/or sham-operated animals. In the cauda region, however, there was an increase in testosterone levels. After the experimental model evaluation, ribonuclease protection assays were performed in order to verify the mRNA expression of muscarinic acetylcholine receptor subtypes. In the caput region, the expression of the transcripts (m1, m2, m3) was not altered by efferent ductules ligation, suggesting that testicular factors proceeding from the rete testis are not involved in the expression of these transcripts. Although in the present study a decrease in the caput of epididymis testosterone was detected after the efferent ductules ligation, this decrease did not alter the expression of these receptors, confirming that these transcripts expression depends on an effective testosterone concentration to induce the modulation, as reported previously in our laboratory. In the cauda of the epididymis, the increase of m2 transcript expression after the efferent ductules ligation may be due to the increase of testosterone concentration in this region, since this transcript has been shown to be modulated mainly by androgens. Taken together, these results suggest that the regulation of muscarinic receptors expression by testicular factors and an effective testosterone concentration delivered in the target tissue differs depending on the epididymal region and the muscarinic receptor subtype analysed. Multiple factors may be involved in the regulation of muscarinic receptors expression in different cell types. These studies point out to the importance of a physiological balance between androgen and testicular factors on the regulation of epididymal function.
A presença de receptores muscarínicos no epidídimo de ratos com 50 dias de idade foi mostrada por estudos moleculares, funcionais e com radioligantes. Considerando a variedade de tipos celulares e suas diferentes funções no epitélio desses tecidos, foi proposto o estudo da localização, função e regulação desses receptores. A localização dos subtipos de receptores muscarínicos M1, M2 e M3 nos dúctulos eferentes e epidídimo foi determinada por meio de ensaios imuno-histoquímicos. Marcação específica com intensidade variável foi observada para cada subtipo de receptor muscarínico dependendo do tipo celular e do órgão analisado. O receptor M1 foi observado nas células ciliadas e não ciliadas dos dúctulos eferentes, enquanto os subtipos M2 e M3 foram detectados na região apical de células ciliadas. Células apicais e estreitas do segmento inicial do epidídimo também mostraram marcação intensa para o subtipo M1, enquanto que uma reação supranuclear foi observada apenas nas células principais da cabeça do epidídimo. Além disso, marcação para os subtipos M1, M2 e M3 foi verificada na região apical de algumas células principais da cauda proximal e distal. O subtipo M3 foi detectado na camada muscular peritubular dos dúctulos eferentes e do epidídimo, consistente com estudos funcionais que mostraram o envolvimento desse receptor no processo contrátil do ducto epididimário da região da cauda. O envolvimento do sistema colinérgico em processos secretórios foi mostrado em vários tecidos. Neste estudo foi observada uma modulação da síntese e/ou secreção protéica pela ativação dos receptores muscarínicos presentes nos dúctulos eferentes e epidídimo de ratos de 50 dias de idade por meio de ensaios in vitro da incorporação total de [35S]- Metionina. Na presença do carbacol houve um aumento na incorporação de [35S]-Metionina nas proteínas secretadas pelos dúctulos eferentes e em proteínas secretadas e teciduais da região da cabeça do epidídimo, quando comparados aos respectivos valores basais (ausência de carbacol). Esses efeitos foram bloqueados pela atropina. A regulação da expressão dos receptores muscarínicos no epidídimo por fatores testiculares foi avaliada utilizando animais submetidos à ligadura bilateral dos dúctulos eferentes por 10 dias. A padronização do modelo experimental foi realizada por meio da análise histo-morfológica dos tecidos, determinação do peso corporal, do peso relativo de órgãos do sistema reprodutor e da concentração de testosterona plasmática e tecidual de animais dos grupos controle, falso-operado e ligadura dos dúctulos eferentes. As alterações observadas pela análise histo-morfológica e pelo peso relativo foram consistentes com as descritas na literatura. Além disso, a concentração de testosterona plasmática de animais após a ligadura dos dúctulos eferentes não apresentou diferença significativa quando comparada com animais falso-operados. Por outro lado, a concentração de testosterona tecidual diferiu dependendo da região do epidídimo analisada e da ligadura dos dúctulos eferentes. Após a ligadura dos dúctulos eferentes houve uma diminuição da concentração de testosterona na região da cabeça do epidídimo, quando comparada com o animal controle e/ou falso-operado. Na região da cauda, no entanto, houve um aumento na concentração de testosterona após a ligadura dos dúctulos eferentes. Após a padronização do modelo experimental, foram realizados os ensaios de proteção à ribonuclease para verificar a expressão do RNA mensageiro para os subtipos de receptores muscarínicos. Na região da cabeça não houve alteração na expressão de nenhum transcrito (m1, m2, m3) após a ligadura dos dúctulos eferentes, indicando que fatores testiculares procedentes do fluido da rete testis não regulam a expressão desses transcritos. Embora no presente estudo tenha sido observada uma diminuição da concentração de testosterona na região da cabeça após a ligadura dos dúctulos eferentes, essa diminuição não foi suficiente para alterar a expressão desses receptores, confirmando a necessidade de uma determinada concentração de testosterona para induzir a modulação deste transcrito, conforme já sugerido anteriormente em nosso laboratório. Na cauda do epidídimo, o aumento da expressão do transcrito m2 após a ligadura dos dúctulos eferentes pode ser devido ao aumento da concentração de testosterona nessa região, uma vez que este transcrito é modulado principalmente pelo andrógeno. Esses resultados, em conjunto, sugerem que a modulação dos receptores muscarínicos pelos fatores testiculares e pela concentração efetiva de testosterona no órgão-alvo difere dependendo da região do epidídimo e do subtipo de receptor muscarínico analisado. Múltiplos fatores devem estar envolvidos na regulação da expressão dos receptores muscarínicos em diferentes células. Esses estudos apontam para a importância da manutenção de um balanço fisiológico do andrógeno e de fatores testiculares na regulação da função do epidídimo.
A presença de receptores muscarínicos no epidídimo de ratos com 50 dias de idade foi mostrada por estudos moleculares, funcionais e com radioligantes. Considerando a variedade de tipos celulares e suas diferentes funções no epitélio desses tecidos, foi proposto o estudo da localização, função e regulação desses receptores. A localização dos subtipos de receptores muscarínicos M1, M2 e M3 nos dúctulos eferentes e epidídimo foi determinada por meio de ensaios imuno-histoquímicos. Marcação específica com intensidade variável foi observada para cada subtipo de receptor muscarínico dependendo do tipo celular e do órgão analisado. O receptor M1 foi observado nas células ciliadas e não ciliadas dos dúctulos eferentes, enquanto os subtipos M2 e M3 foram detectados na região apical de células ciliadas. Células apicais e estreitas do segmento inicial do epidídimo também mostraram marcação intensa para o subtipo M1, enquanto que uma reação supranuclear foi observada apenas nas células principais da cabeça do epidídimo. Além disso, marcação para os subtipos M1, M2 e M3 foi verificada na região apical de algumas células principais da cauda proximal e distal. O subtipo M3 foi detectado na camada muscular peritubular dos dúctulos eferentes e do epidídimo, consistente com estudos funcionais que mostraram o envolvimento desse receptor no processo contrátil do ducto epididimário da região da cauda. O envolvimento do sistema colinérgico em processos secretórios foi mostrado em vários tecidos. Neste estudo foi observada uma modulação da síntese e/ou secreção protéica pela ativação dos receptores muscarínicos presentes nos dúctulos eferentes e epidídimo de ratos de 50 dias de idade por meio de ensaios in vitro da incorporação total de [35S]- Metionina. Na presença do carbacol houve um aumento na incorporação de [35S]-Metionina nas proteínas secretadas pelos dúctulos eferentes e em proteínas secretadas e teciduais da região da cabeça do epidídimo, quando comparados aos respectivos valores basais (ausência de carbacol). Esses efeitos foram bloqueados pela atropina. A regulação da expressão dos receptores muscarínicos no epidídimo por fatores testiculares foi avaliada utilizando animais submetidos à ligadura bilateral dos dúctulos eferentes por 10 dias. A padronização do modelo experimental foi realizada por meio da análise histo-morfológica dos tecidos, determinação do peso corporal, do peso relativo de órgãos do sistema reprodutor e da concentração de testosterona plasmática e tecidual de animais dos grupos controle, falso-operado e ligadura dos dúctulos eferentes. As alterações observadas pela análise histo-morfológica e pelo peso relativo foram consistentes com as descritas na literatura. Além disso, a concentração de testosterona plasmática de animais após a ligadura dos dúctulos eferentes não apresentou diferença significativa quando comparada com animais falso-operados. Por outro lado, a concentração de testosterona tecidual diferiu dependendo da região do epidídimo analisada e da ligadura dos dúctulos eferentes. Após a ligadura dos dúctulos eferentes houve uma diminuição da concentração de testosterona na região da cabeça do epidídimo, quando comparada com o animal controle e/ou falso-operado. Na região da cauda, no entanto, houve um aumento na concentração de testosterona após a ligadura dos dúctulos eferentes. Após a padronização do modelo experimental, foram realizados os ensaios de proteção à ribonuclease para verificar a expressão do RNA mensageiro para os subtipos de receptores muscarínicos. Na região da cabeça não houve alteração na expressão de nenhum transcrito (m1, m2, m3) após a ligadura dos dúctulos eferentes, indicando que fatores testiculares procedentes do fluido da rete testis não regulam a expressão desses transcritos. Embora no presente estudo tenha sido observada uma diminuição da concentração de testosterona na região da cabeça após a ligadura dos dúctulos eferentes, essa diminuição não foi suficiente para alterar a expressão desses receptores, confirmando a necessidade de uma determinada concentração de testosterona para induzir a modulação deste transcrito, conforme já sugerido anteriormente em nosso laboratório. Na cauda do epidídimo, o aumento da expressão do transcrito m2 após a ligadura dos dúctulos eferentes pode ser devido ao aumento da concentração de testosterona nessa região, uma vez que este transcrito é modulado principalmente pelo andrógeno. Esses resultados, em conjunto, sugerem que a modulação dos receptores muscarínicos pelos fatores testiculares e pela concentração efetiva de testosterona no órgão-alvo difere dependendo da região do epidídimo e do subtipo de receptor muscarínico analisado. Múltiplos fatores devem estar envolvidos na regulação da expressão dos receptores muscarínicos em diferentes células. Esses estudos apontam para a importância da manutenção de um balanço fisiológico do andrógeno e de fatores testiculares na regulação da função do epidídimo.
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Citation
SIU, Erica Rosanna. Localização, função e regulação de receptores muscarínicos em dúctulos eferentes e epidídimo de ratos. 2006. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.