Construção de um vetor para expressão controlada de condroitinase AC por células tronco mesenquimais/
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Date
2011-02-22
Authors
Moreira, Caroline Mônaco [UNIFESP]
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Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]
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Dissertação de mestrado
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Abstract
Adult mammal axons fail to regenerate when damaged, generating a fundamental problem, inhibiting the recovery of injured central nervous system (CNS). The lack of full regenerative capacity of the injured CNS is due to a glial scar formation on the injury site. The glial scar is formed by astrocytes, oligodendrocyte precursor cells, and microglia, cells that produce molecules that inhibit axonal regeneration. Chondroitin sulphate proteoglycans are the major responsible for this inhibitory characteristic. Chondroitin sulphate chain degradation by enzymes named chondroitinases reduces local inhibition and increases axonal regeneration. Another possibility to treat CNS injury is cell therapy using mesenchymal stem cells (MSC). MSC can be used to repair injured tissues providing new cells, to replace the damaged ones, or as a source of trophic factors, stimulating the regeneration by secreting bioactive factors. In the present work, we used a combination of two approaches for the treatment of injured CNS: gene and cellular therapies. We have produced a retroviral vector containing the gene for chondroitinase AC (cAC), for the controlled expression of the enzyme, produced the correspondent viruses and tested their transduction capacity in CHO and 9L cells. The expression of cAC was observed in CHO cells. In parallel, we have cultivated MSC that were also transduced with the viruses; however, we have not observed the cAC expression in these cells, suggesting a possible silencing mechanism. Although more studies are needed to the cAC expression by MSC, the combined use of MSC and cAC can be a useful tool for the treatment of injured SNC.
Os axônios adultos de mamíferos falham em regenerarem-se quando danificados, gerando um problema fundamental, que impede a recuperação funcional do sistema nervoso central (SNC) lesado. A falta de capacidade regenerativa apresentada no SNC após lesões é devida à natureza inibitória do ambiente no local da lesão, a cicatriz glial. A cicatriz glial é formada por astrócitos, células precursoras de oligodendrócitos, células da meninge e micróglia, que secretam moléculas que inibem a regeneração axonal. Essa função inibitória é desempenhada, entre outros, por proteoglicanos de condroitim sulfato (PGCS). A degradação das cadeias de CS por enzimas específicas, denominadas condroitinases, reduz a inibição local e aumenta a regeneração dos axônios. Células tronco mesenquimais (CTM) têm sido apresentadas como possíveis alternativas terapêuticas para atuar no reparo de lesões no SNC. As CTM podem ser usadas no reparo de tecidos lesados como provedoras de novas células, a fim de substituir as células mortas, ou como fonte de fatores tróficos, estimulando a regeneração por efeito de fatores bioativos secretados. No presente trabalho, utilizamos a combinação de duas abordagens para a o tratamento de lesões no SNC: a terapia gênica e a terapia celular. Construímos um vetor retroviral contendo o gene da condroitinase AC (cAC), para a expressão controlada da enzima, produzimos os retrovírus correspondentes e testamos sua capacidade de transdução em linhagens celulares estabelecidas (células CHO e 9L). A expressão da cAC foi observada em células CHO. Paralelamente, obtivemos culturas de CTM, que também foram transduzidas com os retrovírus produzidos, mas não apresentaram expressão da enzima, indicando a ocorrência de um possível mecanismo de silenciamento do transgene. Embora mais estudos sejam necessários para que as CTM expressem o gene da cAC e sejam transplantadas nas lesões, o uso combinado de CTM e de cAC ainda poderia ser uma ferramenta útil para o tratamento de lesões no SNC.
Os axônios adultos de mamíferos falham em regenerarem-se quando danificados, gerando um problema fundamental, que impede a recuperação funcional do sistema nervoso central (SNC) lesado. A falta de capacidade regenerativa apresentada no SNC após lesões é devida à natureza inibitória do ambiente no local da lesão, a cicatriz glial. A cicatriz glial é formada por astrócitos, células precursoras de oligodendrócitos, células da meninge e micróglia, que secretam moléculas que inibem a regeneração axonal. Essa função inibitória é desempenhada, entre outros, por proteoglicanos de condroitim sulfato (PGCS). A degradação das cadeias de CS por enzimas específicas, denominadas condroitinases, reduz a inibição local e aumenta a regeneração dos axônios. Células tronco mesenquimais (CTM) têm sido apresentadas como possíveis alternativas terapêuticas para atuar no reparo de lesões no SNC. As CTM podem ser usadas no reparo de tecidos lesados como provedoras de novas células, a fim de substituir as células mortas, ou como fonte de fatores tróficos, estimulando a regeneração por efeito de fatores bioativos secretados. No presente trabalho, utilizamos a combinação de duas abordagens para a o tratamento de lesões no SNC: a terapia gênica e a terapia celular. Construímos um vetor retroviral contendo o gene da condroitinase AC (cAC), para a expressão controlada da enzima, produzimos os retrovírus correspondentes e testamos sua capacidade de transdução em linhagens celulares estabelecidas (células CHO e 9L). A expressão da cAC foi observada em células CHO. Paralelamente, obtivemos culturas de CTM, que também foram transduzidas com os retrovírus produzidos, mas não apresentaram expressão da enzima, indicando a ocorrência de um possível mecanismo de silenciamento do transgene. Embora mais estudos sejam necessários para que as CTM expressem o gene da cAC e sejam transplantadas nas lesões, o uso combinado de CTM e de cAC ainda poderia ser uma ferramenta útil para o tratamento de lesões no SNC.
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Citation
MOREIRA, Caroline Mônaco. Construção de um vetor para expressão controlada de condroitinase AC por células tronco mesenquimais/. 2011. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2011.