Comparações genotípicas e fenotípicas de diferentes isolados clínicos de colonização e candidemia por Candida albicans
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Data
2009-05-27
Autores
Santos, Fernanda Pahim [UNIFESP]
Orientadores
Colombo, Arnaldo Lopes [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Introduction: Candida albicans is part of the human microbiota, but it can cause disseminated infection depending on the host immunity status. It is the most virulent species of the genus Candida as well as is frequently isolated from superficial and systemic infections. Some putative virulence factors have been recently proposed for C. albicans, including: adhesion to host epithelial and endothelial cells, the ability to secrete hydrolytic enzymes, yeast-to-hypha transition and the capability to combat oxidative stress generated by phagocytic cells Objectives: to characterize virulence attributes of different C. albicans clinical isolates; to analyze intraspecific genetic relatedness and to determine antifungal susceptibility of clinical isolates collected from a specific clinical scenario. Material and Methods: We have investigated 51 isolates sequentially obtained from 7 patients divided into 3 different groups: a) 3 patients who were only colonized (17 isolates); b) 3 colonized patients who had candidemia and were discharged (27 isolates); and c) 1 colonized patient who died of candidemia (7 isolates). We have investigated the following virulence factors: maximum growth rates, proteinase and phospholipase activity, adherence to human buccal epithelial cells, morphogenesis and biofilm formation. We also performed antifungal susceptibility testing by using broth microdilution method with amphotericin B, fluconazole, itraconazole, 5-fluorocytosine, caspofungin and anidulafungin. To investigate genetic variability, we have used a microsatellite technique with primer M13, followed by dendrogram construction, in addition to A, B, C genotyping. Results: We have found that all the isolates except strain 657B presented similar growth rates. The strains exhibited variable ability to adhere to buccal epithelia and to for hyphae. Therefore, we could not establish a direct relationship between these virulence attributes and patients clinical outcome. Strains obtained from patient 7, belonging to group III (candidemia/death) had the highest levels of proteinase activity, seconded by the isolates collected from patient 4 (candidemia/discharge). Phospholipase activity was essentially the same for all the isolates investigated in the present study, except from some patient 4 strains (candidemia/discharge) which were phospholipase negative. Isolates from patients 4 (candidemia/discharge), and 7 (candidemia/death) showed the highest levels of biofilm formation. We could not detect resistance to antifungal drugs among the isolates. However, a unique strain was DDS to 5-fluorocytosine (170 A). Microsatelite and A, B, C typing demonstrated that isolates from groups II and III (candidemia) showed lower genetic variability than the strains belonging to group I (only colonized). Conclusion: It was possible to verify that besides host immunity, each isolate had particular aspects which could be important factors to guarantee their success as pathogens. In addition, we emphasize the importance of molecular tools to detect genotypes well adapted to the human organism, which are likely responsible for worse prognosis in the hospital environment.
Introdução: Candida albicans faz parte da microbiota humana, entretanto pode causar infecção disseminada a depender das condições imunológicas do hospedeiro. Trata-se da espécie mais virulenta do gênero Candida, além de ser isolada com freqüência em infecções superficiais e sistêmicas. Alguns fatores de virulência são atualmente propostos para C. albicans, incluindo: adesão a células epiteliais e endoteliais do hospedeiro, a capacidade de secretar enzimas hidrolíticas, a transição de levedura à hifa e a capacidade de combate ao estresse oxidativo, gerado por células fagocitárias Objetivos: caracterizar atributos de virulência em diferentes isolados clínicos de C. albicans; analisar o relacionamento genético intraespecífico e, determinar o perfil de susceptibilidade dos mesmos. Material e Métodos: Foram incluídos 51 isolados sequencialmente obtidos de 7 pacientes alocados em 3 grupos: a) 3 pacientes que foram apenas colonizados (17 isolados); b) 3 pacientes colonizados que evluíram com candidemia e alta hospitalar (27 isolados); e c) 1 paciente colonizado que evoluiu com candidemia e óbito (7 isolados). Foram determinados os seguintes fatores de virulência: taxas de crescimento máximas, atividade de proteinase específica, atividade de fosfolipase, aderência de células de C. albicans à células epiteliais bucais humanas (CEBH), ensaio de morfogênese,formação do biolfilme. Foram realizados teste de susceptibilidade a antifúngicos (TSA) pelo método de microdiluição em caldo, utilizando anfotericina B, fluconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina, caspofungina e anidulafungina. Para avaliar a variabilidade genética empregou-se técnica de microssatélites utilizando o “primer” M13, com posterior montagem de dendrograma. Foi também empregada a genotipagem ABC. Resultados: Observou-se que todas as cepas apresentaram similar taxa de crescimento, à exceção de um isolado (657B). As amostras apresentaram capacidade de aderência a CEBH e formação de hifa variáveis, não havendo associação direta entre estes atributos e o desfecho clínico do paciente. Na avaliação de secreção de Saps, os isolados do paciente 7, pertencente ao grupo III (candidemia/óbito), apresentaram os maiores valores de secreção desta enzima entre os isolados avaliados, seguida das cepas do paciente 4 (candidemia/alta). A produção de fosfolipase em nosso estudo foi homogênea para todos os isolados testados à exceção dos isolados do paciente 4 (candidemia/alta), o qual apresentou diversas cepas com atividade de fosfolipase negativa. Os pacientes 4 (candidemia/alta), e 7 (candidemia/óbito), obtiveram as maiores taxas de formação de biofilme entre todos os isolados testados. Quanto ao TSA, não houve ocorrência de resistência entre os isolados, porém uma única cepa (170 A) apresentou-se SDD frente a 5-fluorocitosina. As técnica de microssatelite e genotipagem ABC evidenciam que aquelas cepas dos grupos II e III apresentam uma menor variabilidade genética do que aquelas oriundas de pacientes do grupo I (somente colonização). Conclusão: Foi possível verificar que além do “status” imunológico do paciente, os aspectos intrínsecos de cada cepa são importantes determinantes do sucesso de sua trajetória como patógeno. Adicionalmente, destacamos a importância de ferramentas moleculares na detecção de genótipos melhor adaptados ao organismo humano, possivelmente responsáveis pelos piores prognósticos clínicos em ambiente hospitalar.
Introdução: Candida albicans faz parte da microbiota humana, entretanto pode causar infecção disseminada a depender das condições imunológicas do hospedeiro. Trata-se da espécie mais virulenta do gênero Candida, além de ser isolada com freqüência em infecções superficiais e sistêmicas. Alguns fatores de virulência são atualmente propostos para C. albicans, incluindo: adesão a células epiteliais e endoteliais do hospedeiro, a capacidade de secretar enzimas hidrolíticas, a transição de levedura à hifa e a capacidade de combate ao estresse oxidativo, gerado por células fagocitárias Objetivos: caracterizar atributos de virulência em diferentes isolados clínicos de C. albicans; analisar o relacionamento genético intraespecífico e, determinar o perfil de susceptibilidade dos mesmos. Material e Métodos: Foram incluídos 51 isolados sequencialmente obtidos de 7 pacientes alocados em 3 grupos: a) 3 pacientes que foram apenas colonizados (17 isolados); b) 3 pacientes colonizados que evluíram com candidemia e alta hospitalar (27 isolados); e c) 1 paciente colonizado que evoluiu com candidemia e óbito (7 isolados). Foram determinados os seguintes fatores de virulência: taxas de crescimento máximas, atividade de proteinase específica, atividade de fosfolipase, aderência de células de C. albicans à células epiteliais bucais humanas (CEBH), ensaio de morfogênese,formação do biolfilme. Foram realizados teste de susceptibilidade a antifúngicos (TSA) pelo método de microdiluição em caldo, utilizando anfotericina B, fluconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina, caspofungina e anidulafungina. Para avaliar a variabilidade genética empregou-se técnica de microssatélites utilizando o “primer” M13, com posterior montagem de dendrograma. Foi também empregada a genotipagem ABC. Resultados: Observou-se que todas as cepas apresentaram similar taxa de crescimento, à exceção de um isolado (657B). As amostras apresentaram capacidade de aderência a CEBH e formação de hifa variáveis, não havendo associação direta entre estes atributos e o desfecho clínico do paciente. Na avaliação de secreção de Saps, os isolados do paciente 7, pertencente ao grupo III (candidemia/óbito), apresentaram os maiores valores de secreção desta enzima entre os isolados avaliados, seguida das cepas do paciente 4 (candidemia/alta). A produção de fosfolipase em nosso estudo foi homogênea para todos os isolados testados à exceção dos isolados do paciente 4 (candidemia/alta), o qual apresentou diversas cepas com atividade de fosfolipase negativa. Os pacientes 4 (candidemia/alta), e 7 (candidemia/óbito), obtiveram as maiores taxas de formação de biofilme entre todos os isolados testados. Quanto ao TSA, não houve ocorrência de resistência entre os isolados, porém uma única cepa (170 A) apresentou-se SDD frente a 5-fluorocitosina. As técnica de microssatelite e genotipagem ABC evidenciam que aquelas cepas dos grupos II e III apresentam uma menor variabilidade genética do que aquelas oriundas de pacientes do grupo I (somente colonização). Conclusão: Foi possível verificar que além do “status” imunológico do paciente, os aspectos intrínsecos de cada cepa são importantes determinantes do sucesso de sua trajetória como patógeno. Adicionalmente, destacamos a importância de ferramentas moleculares na detecção de genótipos melhor adaptados ao organismo humano, possivelmente responsáveis pelos piores prognósticos clínicos em ambiente hospitalar.
Descrição
Citação
SANTOS, Fernanda Pahim. Comparações genotípicas e fenotípicas de diferentes isolados clínicos de colonização e candidemia por Candida albicans. 2009. 152 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.