Obtenção, caracterização e reconstituição da protease PgtE de Salmonella enterica sorovar Typhimurium em lipossomos: um estudo do mecanismo de resistência aos peptídeos antimicrobianos
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Data
2020-09-24
Autores
Silva, Pamela Jacque De Souza Nascimento Da [UNIFESP]
Orientadores
Perez, Katia Regina [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Multidrug-resistant gram-negative bacteria represents one of the most prominent public health problems worldwide. Omptin family of the Outer membrane protein, such as PgtE from Salmonella spp. Enterica serovar Typhimurium, are able to cleave a variety of protein substrates, including antimicrobial peptides that have shown promise in the treatment of multi-resistant bacteria. Objective: to obtain and characterize the PAM-resistant proteoliposomes of S. typhi from the incorporation of the recombinant PgtE protein in liposomes. Methods: In this work, we describe how to use recombinant PgtE in its soluble and active form by cloning the gene encoding native PgtE S. typhi in the pET 28a (+) expression vector. The recombinant proteins expression was conducted in the hosted type E. coli BL21 (Dε3) under moderate conditions to avoid protein aggregation in inclusion bodies. It also describes the rational development of the protocols used for the extraction of proteins from the membrane through solubilization with the surfactant SDS. After protein solubilization, establish a convenient purification protocol to obtain a protein with a high degree of homogeneity and proteolytic activity used with SDS and CHAPS surfactant. Determined as kinetic constants (kcat, KM and kcat/KM) against a peptide substrate with intramolecular suppression of fluorescence in order to analyze the specific activity of the recombinant protein used in its solubilized and purified form. To use the proteoliposomes, we perform the incorporation of the recombinant protein in the DPPC or DPPC:DPPG 1:1 liposomes using the co-solubilization method that uses the BioBeads® resin. And it characterizes these proteoliposomes that are conducted by biophysical approaches of calorimetry through DSC and fluorescence to evaluate how changes in the incorporation in the thermodynamic characteristics of the membranes, as well as in the recovery of enzymatic activity when a substance is reconstituted. Results: The use of surfactant was important to obtain recombinant PgtE in its active soluble form after being removed from the lipid bilayer. The optimization of the solubilization and purification protocol using the SDS and CHAPS surfactants allowed obtaining the soluble and active protein with the highest possible yield and a high degree of homogeneity. The incorporation by the method of co-solubilization of lipids, protein and detergent with subsequent selective adsorption of the detergent using the Biobeads® resin was a methodology for obtaining the DPPC and DPPC proteoliposomes: effective DPPG, since we reached values between 87,1 and 90,7% xix protein incorporation yield. The DSC assays showed a more significant change in the profile of the membrane lipids phase transition thermogram, greater changes in the ∆H and in the cooperativity of the lipids of proteoliposomes made up of DPPC: DPPG. Kinetic assays suggest that negative charge on the membrane may influence PgtE activity. Conclusion: The strategies adopted in all stages, from obtaining the protein and purification to the characterization of the proteoliposome system, allowed to study the proteolytic mode of action of PgtE in a less complex and non-pathogenic system and opportunity to allowing the study of candidate peptides to treatment of infections by multi-resistant bacteria as an alternative to treatment using antibiotics.
As bactérias gram-negativas multirresistentes representam um dos problemas de saúde pública mais proeminente no mundo. Proteases de membrana externa da família das Omptinas, como PgtE de Salmonella subespécie. enterica sorovar Typhimurium, são capazes de clivar os peptídeos antimicrobianos (PAMs) que têm se mostrado promissores no tratamento de bactérias multirresistentes. Objetivo: obter e caracterizar proteolipossomos de S. typhi resistentes aos PAMs a partir da incorporação da proteína recombinante PgtE em lipossomos. Métodos: descrevemos a obtenção da PgtE recombinante na sua forma solúvel e ativa através da clonagem do gene em vetor de expressão pET 28a(+). A expressão foi conduzida na estirpe hospedeira E. coli BL21 (Dε3) em condições moderadas para evitar a agregação proteica em corpos de inclusão. Descrevemos também o desenvolvimento racional dos protocolos utilizados para a extração proteína da membrana através da solubilização com o surfactante SDS. Após a solubilização da proteína, estabelecemos um protocolo de purificação conveniente para obter a proteína com alto grau de homogeneidade e atividade proteolítica utilizando-se o surfactante CHAPS. Determinamos as constantes cinéticas (kcat, KM e kcat/KM) frente a substrato peptídico com supressão intramolecular de fluorescência de forma a analisar a atividade específica da PgtE recombinante obtida na sua forma solubilizada e purificada. Para a obtenção dos proteolipossomos, realizamos a incorporação da proteína recombinante em lipossomas de DPPC ou DPPC:DPPG 1:1 empregando o método de co-solubilização utilizando a resina BioBeads®. A caracterização destes proteolipossomos foram conduzidas por abordagens biofísicas de calorimetria através do DSC e fluorescência para avaliar as alterações da incorporação nas propriedades termodinâmicas das membranas bem como a recuperação da atividade enzimática quando a proteína é reconstituída nestes sistemas. Resultados: O uso de solubilizantes adequados do tipo surfactante foi importante para obter a PgtE recombinante na sua forma solúvel ativa após ser retirada da bicamada lipídica. A otimização no protocolo de solubilização e purificação utilizando os surfactantes SDS e CHAPS possibilitaram a obtenção da proteína solúvel e ativa com maior rendimento possível e alto grau de homogeneidade. A incorporação pelo método de co-solubilização de lipídeos, proteína e detergente com subsequente adsorção seletiva do detergente xvii utilizando a resina Biobeads® foi uma metodologia de obtenção dos proteolipossomos de DPPC e DPPC:DPPG eficaz, uma vez que, alcançamos valores entre 87,1 e 90,7% de rendimento de incorporação de proteína. Os ensaios de DSC evidenciaram uma alteração mais significativa no perfil do termograma de transição de fase dos lipídeos da membrana, maiores alterações no ∆H e na cooperatividade dos lipídeos de proteolipossomos constituídos de DPPC:DPPG. Os ensaios cinéticos sugerem que carga negativa na membrana pode influenciar na atividade da PgtE. Conclusão: As estratégias adotadas em todas as etapas, desde a obtenção da proteína e purificação até a caracterização do sistema de proteolipossomos, permitiram estudar o modo de ação proteolítico da PgtE em um sistema menos complexo e não patogênico, além de permitir oportunamente estudar peptídeos candidatos ao tratamento de infecções por bactérias multirresistentes como alternativa ao tratamento utilizando antibióticos.
As bactérias gram-negativas multirresistentes representam um dos problemas de saúde pública mais proeminente no mundo. Proteases de membrana externa da família das Omptinas, como PgtE de Salmonella subespécie. enterica sorovar Typhimurium, são capazes de clivar os peptídeos antimicrobianos (PAMs) que têm se mostrado promissores no tratamento de bactérias multirresistentes. Objetivo: obter e caracterizar proteolipossomos de S. typhi resistentes aos PAMs a partir da incorporação da proteína recombinante PgtE em lipossomos. Métodos: descrevemos a obtenção da PgtE recombinante na sua forma solúvel e ativa através da clonagem do gene em vetor de expressão pET 28a(+). A expressão foi conduzida na estirpe hospedeira E. coli BL21 (Dε3) em condições moderadas para evitar a agregação proteica em corpos de inclusão. Descrevemos também o desenvolvimento racional dos protocolos utilizados para a extração proteína da membrana através da solubilização com o surfactante SDS. Após a solubilização da proteína, estabelecemos um protocolo de purificação conveniente para obter a proteína com alto grau de homogeneidade e atividade proteolítica utilizando-se o surfactante CHAPS. Determinamos as constantes cinéticas (kcat, KM e kcat/KM) frente a substrato peptídico com supressão intramolecular de fluorescência de forma a analisar a atividade específica da PgtE recombinante obtida na sua forma solubilizada e purificada. Para a obtenção dos proteolipossomos, realizamos a incorporação da proteína recombinante em lipossomas de DPPC ou DPPC:DPPG 1:1 empregando o método de co-solubilização utilizando a resina BioBeads®. A caracterização destes proteolipossomos foram conduzidas por abordagens biofísicas de calorimetria através do DSC e fluorescência para avaliar as alterações da incorporação nas propriedades termodinâmicas das membranas bem como a recuperação da atividade enzimática quando a proteína é reconstituída nestes sistemas. Resultados: O uso de solubilizantes adequados do tipo surfactante foi importante para obter a PgtE recombinante na sua forma solúvel ativa após ser retirada da bicamada lipídica. A otimização no protocolo de solubilização e purificação utilizando os surfactantes SDS e CHAPS possibilitaram a obtenção da proteína solúvel e ativa com maior rendimento possível e alto grau de homogeneidade. A incorporação pelo método de co-solubilização de lipídeos, proteína e detergente com subsequente adsorção seletiva do detergente xvii utilizando a resina Biobeads® foi uma metodologia de obtenção dos proteolipossomos de DPPC e DPPC:DPPG eficaz, uma vez que, alcançamos valores entre 87,1 e 90,7% de rendimento de incorporação de proteína. Os ensaios de DSC evidenciaram uma alteração mais significativa no perfil do termograma de transição de fase dos lipídeos da membrana, maiores alterações no ∆H e na cooperatividade dos lipídeos de proteolipossomos constituídos de DPPC:DPPG. Os ensaios cinéticos sugerem que carga negativa na membrana pode influenciar na atividade da PgtE. Conclusão: As estratégias adotadas em todas as etapas, desde a obtenção da proteína e purificação até a caracterização do sistema de proteolipossomos, permitiram estudar o modo de ação proteolítico da PgtE em um sistema menos complexo e não patogênico, além de permitir oportunamente estudar peptídeos candidatos ao tratamento de infecções por bactérias multirresistentes como alternativa ao tratamento utilizando antibióticos.