Modulação do eixo PLCγ1, Ca2+/CAMKII e PKC em células de leucemia mieloide crônica tratadas com violaceína
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Data
2020-07-30
Autores
Miura, Natalia Tamagusko [UNIFESP]
Orientadores
Justo, Giselle Zenker [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Violacein is an indole derivative isolated from Chromobacterium violaceum with potential antitumor activity and specific mechanisms of action in vitro and in vivo. This compound was evaluated in vitro in cultures of chronic myeloid leukemia (CML), which is a myeloproliferative disease associated with a genetic translocation that leads to the formation of the BCR-ABL oncoprotein. BCR-ABL is capable of inducing multiple signal transduction pathways responsible for the leukemogenic process. Moreover, BCR-ABL acts with additional mechanisms, dependent or independent of BCR-ABL, to induce resistance, leading to an unfavorable prognosis in the treatment of the disease and the search for alternative drug therapies. One of the factors that lead to the phenotype of multiple drug resistance (MDR) is related to the increase in the expression of efflux pumps, among them, the P glycoproteins (Pgp), which is one of the most studied mechanisms of chemoresistance in CML. Hence, we compared the phosphoproteomic profile of K562 cells and their variant that overexpresses the Pgp and, therefore, presents the MDR phenotype, the Lucena 1 cell line, using a microarray approach of peptides that allows to analyze the activity of different cell kinases. Data analysis showed that the exposure of K562 cells to violacein significantly modulated 13 kinases, whereas the activity of 6 kinases in Lucena 1 cells showed significant changes after treatment. The results showed a reduction in the activity of Axl and c-Met in K562 cells, while p38MAPK and JNK stimulation were observed in Lucena 1 cells. Of particular importance, the quinoma analysis indicated significant modulation in protein kinase C (PKC) activity after treatment of cells of both strains with violacein. In this sense, a reduction in phosphorylation of PKCα(Ser657) by immunoblotting was also observed. On the other hand, the pretreatment of cells with the specific classic PKC inhibitor, chelerythrine, inhibited about 80% of cell death induced by violacein, corroborating the increase in intracellular Ca2+ concentration. In addition, a significant increase in CAMKII(Thr286) activity was observed, suggesting that stimulation of the Ca2+/CAMKII axis and PKCs is important for cell death induced by violacein. In addition, the results also demonstrated the inhibition of PLCγ1(Tyr783), suggesting that this effect is also involved in inducing cell death. Together, the results indicate an important role for Ca2+ signaling and PLCγ1 inhibition in violacein-induced CML cell death. They also open perspectives for investigating new targets of action of this naturally derived compound.
A violaceína é um derivado indólico isolado da Chromobacterium violaceum com potencial atividade antitumoral e mecanismos de ação específicos in vitro e in vivo. Esse composto foi avaliado in vitro em cultura de células de leucemia mielóide crônica (LMC) que é uma neoplasia mieloproliferativa associada a uma translocação genética que leva à formação da oncoproteína BCR-ABL, a qual é capaz de induzir múltiplas vias de transdução de sinal responsáveis pelo processo leucemogênico. Além disso, BCR-ABL age com mecanismos adicionais dependentes ou independentes de BCR-ABL para induzir resistência levando a um prognóstico desfavorável no tratamento da doença e à busca por terapias medicamentosas alternativas. Um dos fatores que leva ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) está relacionado ao aumento da expressão de bombas de efluxo, dentre elas, a glicoproteínas P (Pgp), sendo este um dos mecanismos mais estudados de quimiorresistência na LMC. Assim, comparamos o perfil fosfoproteômico de células K562 e sua variante que superexpressa a Pgp e, portanto, apresenta o fenótipo MDR, a linhagem Lucena 1, tratadas com 3,0 µmol/L de violaceína por 24 h, usando uma abordagem de microarranjos de peptídeos que permite analisar a atividade de diferentes quinases celulares. A análise dos dados mostrou que a exposição das células K562 à violaceína modulou significativamente 13 quinases, enquanto 6 quinases em células Lucena 1 apresentaram alterações significativas na atividade após o tratamento. Os resultados mostraram redução na atividade de Axl e c-Met em células K562, enquanto que estímulo de p38MAPK e JNK foram observados em células Lucena 1. De particular importância, a análise do quinoma indicou modulação significativa na atividade de proteína quinase C (PKC) após o tratamento das células de ambas linhagens com violaceína. Neste sentido, também se observou uma redução na fosforilação de PKCα(Ser657) por immunoblotting. Por outro lado, o pré-tratamento das células com o inibidor específico de PKC clássica, queleritrine, inibiu em torno de 80% da morte celular induzida por violaceína, corroborando com o aumento da concentração de Ca2+ intracelular. Além disso, observou-se aumento significativo da atividade de CAMKII(Thr286), sugerindo que a estimulação do eixo Ca2+/CAMKII e PKCs seja importante para a morte celular induzida por violaceína. Além disso, os resultados também demonstraram inibição de PLCγ1(Tyr783), sugerindo que este efeito também esteja associado à indução de morte celular. Em conjunto, os resultados indicam um importante papel para a sinalização de Ca2+ e inibição de PLCγ1 na morte de células de LMC induzida por violaceína, além de abrir perspectivas de investigação de novos alvos de ação deste derivado de origem natural.
A violaceína é um derivado indólico isolado da Chromobacterium violaceum com potencial atividade antitumoral e mecanismos de ação específicos in vitro e in vivo. Esse composto foi avaliado in vitro em cultura de células de leucemia mielóide crônica (LMC) que é uma neoplasia mieloproliferativa associada a uma translocação genética que leva à formação da oncoproteína BCR-ABL, a qual é capaz de induzir múltiplas vias de transdução de sinal responsáveis pelo processo leucemogênico. Além disso, BCR-ABL age com mecanismos adicionais dependentes ou independentes de BCR-ABL para induzir resistência levando a um prognóstico desfavorável no tratamento da doença e à busca por terapias medicamentosas alternativas. Um dos fatores que leva ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) está relacionado ao aumento da expressão de bombas de efluxo, dentre elas, a glicoproteínas P (Pgp), sendo este um dos mecanismos mais estudados de quimiorresistência na LMC. Assim, comparamos o perfil fosfoproteômico de células K562 e sua variante que superexpressa a Pgp e, portanto, apresenta o fenótipo MDR, a linhagem Lucena 1, tratadas com 3,0 µmol/L de violaceína por 24 h, usando uma abordagem de microarranjos de peptídeos que permite analisar a atividade de diferentes quinases celulares. A análise dos dados mostrou que a exposição das células K562 à violaceína modulou significativamente 13 quinases, enquanto 6 quinases em células Lucena 1 apresentaram alterações significativas na atividade após o tratamento. Os resultados mostraram redução na atividade de Axl e c-Met em células K562, enquanto que estímulo de p38MAPK e JNK foram observados em células Lucena 1. De particular importância, a análise do quinoma indicou modulação significativa na atividade de proteína quinase C (PKC) após o tratamento das células de ambas linhagens com violaceína. Neste sentido, também se observou uma redução na fosforilação de PKCα(Ser657) por immunoblotting. Por outro lado, o pré-tratamento das células com o inibidor específico de PKC clássica, queleritrine, inibiu em torno de 80% da morte celular induzida por violaceína, corroborando com o aumento da concentração de Ca2+ intracelular. Além disso, observou-se aumento significativo da atividade de CAMKII(Thr286), sugerindo que a estimulação do eixo Ca2+/CAMKII e PKCs seja importante para a morte celular induzida por violaceína. Além disso, os resultados também demonstraram inibição de PLCγ1(Tyr783), sugerindo que este efeito também esteja associado à indução de morte celular. Em conjunto, os resultados indicam um importante papel para a sinalização de Ca2+ e inibição de PLCγ1 na morte de células de LMC induzida por violaceína, além de abrir perspectivas de investigação de novos alvos de ação deste derivado de origem natural.