Produção e Caracterização in silico da Proteína Inibidora de elastase de neutrófilos (NEI) recombinante do carrapato Rhipicephalus microplus: uma candidata para tratamento de desordens inflamatórias
Data
2021-06-02
Autores
Leite, Gabriela Karen 
Orientadores
Campos, Claudia Barbosa Ladeira de
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Os carrapatos, tais quais o Rhipicephalus microplus, são artrópodes ectoparasitas hematófagos, que precisam permanecer fixos aos seus hospedeiros durante todo o tempo de vida para se alimentarem. Para tal, secretam diversas moléculas em sua saliva a fim de evadir a resposta imune do hospedeiro. Ao estudar essas diferentes moléculas, observa-se uma grande gama de potenciais imunobiológicos que podem atuar como efetores farmacológicos contra desordens inflamatórias causadas ou não por patógenos. Um dos desafios está em estabelecer formas de produção destas moléculas com baixo custo e grande rendimento. O objetivo do trabalho foi a produção da proteína inibidora de elastase de neutrófilo (NEI) recombinante em Escherichia coli e em Pichia pastoris, cuja sequência primária foi derivada do sialotranscriptoma do carrapato R. microplus, e a sua caracterização in silico. Conduzimos esse projeto, comparando os dois sistemas de produção de proteínas recombinantes, em pequena e larga escala em laboratório. Também foram realizados métodos de purificação como a cromatografia por afinidade e por gel filtração, para posteriormente ser utilizada na investigação do seu potencial farmacológico em modelos experimentais murinos. Para validar esse potencial, comparamos a nossa proteína de interesse com proteínas já caracterizadas como Inibidoras de elastase de carrapatos como R. microplus, A. monolakensis, I. scapularis, H. asiaticum, I. persulcatus, O. parkeri, H. dromedarii H. marginatum rufipe, A. delacruzi, A. triste, e A. cajennense e A. parvvum assim como do mosquito C. tarsalis.
Esse comparativo foi feito via comparações filogenéticas e estruturais em vários níveis (verificando estruturas primarias, secundarias e tridimensionais). Nesse projeto, revistando os principais processos biotecnológicos de produção de proteínas recombinantes usando técnicas como crescimento em meio LB, usando a via do OperonLac e para concentração de proteínas por diálise usado no processo de produção via E. coli competentes, assim como crescendo em meios específicos com protocolos de produção proteica otimizados, ativando a produção da proteína de interesse usando metanol e usando instrumentos como NanoDrop para garantir a concentração a proteína produzida conseguiu-se definir o protocolo de P. pastoris como o de melhor rendimento e fácil purificação para utilização em modelos in vivo. Os resultados deste trabalho podem contribuir com um potencial candidata para tratamento de doenças inflamatórias com exacerbação da ação neutrofílica.
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Leite, G. K. Produção e Caracterização in silico da Proteína Inibidora de elastase de neutrófilos (NEI) recombinante do carrapato Rhipicephalus microplus: uma candidata para tratamento de desordens inflamatórias. Dissertação de mestrado. 2021.