PPG - Biotecnologia
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- ItemPromotores transcricionais específicos de colmo de cana-de-açúcar para fins biotecnológicos(Universidade Federal de São Paulo, 2023-09-05) Souza, Marinara Alves [UNIFESP]; Brito, Michael dos Santos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1357542636768944; http://lattes.cnpq.br/6027771260671581Segundo dados da Empresa de Pesquisa Energética – EPE (2023), 15,4% da energia utilizada pelo Brasil em 2022 foi produzida a partir da biomassa de cana-de-açúcar. O colmo da cana-de-açúcar pode ser utilizado para produção de etanol de primeira e segunda geração, queima em termelétricas, produção de solventes e produtos alimentícios. O estudo de promotores transcricionais específicos de colmo de cana-de-açúcar pode ser de grande valor para a ciência básica e aplicações biotecnológicas. O objetivo deste trabalho foi prospectar promotores específicos de colmo de cana-de-açúcar, caracterizar o perfil de expressão dos genes regulados por estes promotores e analisar os promotores quanto aos seus sítios de ligação a fatores de transcrição. Os candidatos foram prospectados na plataforma Sucest-fun e quatro genes apresentaram expressão específica em colmo através das análises in silico. O perfil de expressão gênica dos genes regulados pelos promotores foi checado via PCR tempo real. Dois genes de referência (Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase – GAPDH e Tubulina) foram validados como bons normalizadores para as amostras e condições de PCR tempo real utilizadas. Dos quatro candidatos testados, dois tiveram o perfil colmo-específico confirmado no PCR tempo real. Esses dois últimos tiveram seus promotores analisados quanto à posição do sítio de início da transcrição, elementos cis-regulatórios dos promotores putativos e sítios de ligação à fatores de transcrição ligados a vias de interesse biotecnológico. Foram encontrados elementos regulatórios TATA box, CAAT box e Inr nos promotores putativos analisados. Foram encontrados sítios de ligação à fatores de transcrição pertencentes a 68 famílias, no entanto não foi possível identificar as sequências regulatórias responsáveis pelo perfil colmo-específico. Diversas famílias de fatores de transcrição envolvidas em vias de regulação de compostos de parede celular e de acúmulo de sacarose apresentaram sítios de ligação nos promotores analisados. Foi possível amplificar um dos promotores colmo-específicos por PCR convencional. Os resultados aqui obtidos viabilizam a análise experimental da atividade dos promotores específicos de colmo.
- ItemDesenvolvimento de curativo a base de kefiran e própolis em matriz polimérica para recobrimento de lesões teciduais(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-08) Martins, Eduardo Ferreira [UNIFESP]; Esposito, Elisa [UNIFESP]; Passador, Fábio Roberto [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0152213852695153; http://lattes.cnpq.br/0121461197043560; http://lattes.cnpq.br/0027792317209654Entre 2008 e 2016 o Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde (SUS) registrou um número de 37.565.785 procedimentos cirúrgicos realizados pelo Sistema. Dentre estes procedimentos, 1,63% resultaram na morte do paciente, podendo ser quase a metade deste número atribuída a infecções nosocomiais decorrentes dos procedimentos pós-operatórios. Outro dado importante relacionado a lesões cutâneas é o número de pessoas que tratam queimaduras por ano no Brasil, que foi de aproximadamente 1 milhão de pacientes em 2017, dos quais cerca de 2500 vieram a óbito. Dentre as causas das mortes estão a profundidade da queimadura, a demora no socorro e, principalmente, a dificuldade em tratar determinadas lesões que podem acarretar processos infecciosos. Desta forma têm-se duas situações claras e pujantes da necessidade do desenvolvimento de novos materiais e substâncias que possam auxiliar nos tratamentos de injúrias cutâneas e garantir uma melhor recuperação e qualidade de vida para o paciente. A própolis é uma resina produzida por abelhas que pode ser utilizada na confecção de novos materiais, uma vez que apresenta propriedades favoráveis, sendo elas atividade antimicrobiana, antifúngica, cicatrizante e antioxidante, podendo ser um componente promissor para curativos. Um segundo produto de origem natural avaliado é o kefiran, um exopolissacarídeo produzido por grãos de kefir de leite no seu processo fermentativo com elevado potencial antimicrobiano, antinflamatório e cicatrizante. A associação destes compostos possui elevado interesse biotecnológico para busca da promoção da saúde, tendo sido estudada através da sua dispersão em uma emulsão farmacológica e utilizando um filme polimérico fino como matriz de suporte. Os extratos de própolis foram produzidos e caracterizados quanto às suas propriedades físico-químicas, bem como kefiran, produzido por microrganismos isolados dos grãos de kefir, as bases e os filmes poliméricos, de modo a fornecer informações acerca das possibilidades de sua associação na formação de um curativo bioativo para aplicação no tratamento de lesões cutâneas. As caracterizações se basearam em propriedades estruturais, térmicas, organolépticas e de propriedades biológicas, dentre outras caracterizações realizadas. Os protocolos de produção das amostras de extrato de própolis originaram diferentes extratos, sendo o extrato etanólico de própolis verde o principal candidato para a aplicação pretendida, diante de seu teor de extrato seco (69,14%) e boa atividade antimicrobiana, com índices de inibição acima de 90%. O kefiran foi produzido e caracterizado com sucesso utilizando culturas de microrganismos isolados, apresentando elevado índice de pureza (97,95%) e rendimento (1,33g/L), condizente com o esperado e proporcionando, também, boa atividade antimicrobiana (também com índices de inibição superiores a 90% a depender da concentração). Os filmes poliméricos produzidos apresentaram boas propriedades térmicas e coeficientes de barreira adequados para a aplicação em pele, sendo o filme produzido a partir da blenda dos polietilenos de alta densidade (HDPE) e linear de baixa densidade (LLDPE) o detentor do melhor coeficiente de permeseletividade encontrado nas amostras testadas (3,2 Barrer). Deste modo, foi possível associar o extrato de própolis e o kefiran à duas bases farmacológicas (anidra e gel) de modo a produzir um novo material com elevado interesse tecnológico e farmacêutico.
- ItemPerfil transcricional e proteômico de leveduras de P. brasiliensis presentes em lesões granulomatosas crônicas de camundongos C57BL/6(Universidade Federal de São Paulo, 2023-08-24) Borges, Bruno Montanari [UNIFESP]; Loures, Flávio Vieira [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1228226400148048; http://lattes.cnpq.br/7320496848371974Granulomas são estruturas imunológicas envolvidas na defesa de hospedeiros contra o fungo Paracoccidioides brasiliensis, principal agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica granulomatosa endêmica na América Latina. Estudos com transcritos em lesões granulomatosas podem revelar importantes genes que atuam no granuloma, permitindo uma melhor compreensão de mecanismos da relação fungo-hospedeiro. Igualmente, um proteoma das leveduras granulomatosas e estudos das vesículas extracelulares (EVs) produzidas por esses fungos podem apontar importantes mecanismos de virulência expressos sob as condições de estresse resultantes da atividade do sistema imunológico no granuloma. Portanto, camundongos C57BL/6 foram infectados com leveduras do P. brasiliensis e após 8 e 12 semanas de infecção, as lesões granulomatosas foram obtidas e o RNA fúngico e murino extraídos. Proteínas fúngicas também foram obtidas. Ademais, leveduras presentes nas lesões foram posteriormente cultivadas e submetidas a outro ensaio proteômico e à extração de suas EVs, as quais foram utilizadas no desafio de macrófagos e células dendríticas, e no estudo da resposta adaptativa celular desenvolvida por linfócitos em cocultivo com as células inatas. Os transcritos evidenciaram atividade gênica relaciona a neutrófilos, macrófagos e linfócitos, além de uma resposta Th1/Th17 presente nas lesões. Transcritos para o CTLA-4, PD-1 e arginase-1, evidenciam a ação de mecanismos regulatórios. Os transcritos fúngicos apontam para um aumento da produção de sideróforos para captura de ferro, mecanismo de virulência fúngico nunca observado em granulomas. Adicionalmente, transcritos e proteoma apontam para uma repressão da atividade fúngica dentro do granuloma. Contudo, foi visto que após o cultivo dessas leveduras extraídas das lesões granulomatosas o metabolismo do fungo foi induzido, apresentando maior abundância de proteínas relacionadas ao metabolismo energético e fatores de virulência, mostrando que após a passagem do fungo pelo granuloma a virulência é aumentada, confirmação feita por ensaios de sobrevida. Além disso, foi visto pelo proteoma das EVs que elas auxiliam na indução do metabolismo e virulência fúngica, sendo capazes inclusive de modular uma resposta imunológica. Do fato, em resposta às EVs, células apresentadoras de antígeno tiveram menor ativação quando comparado ao estímulo dado por EVs controles. Ademais, as EVs do fungo recuperado do granuloma induziram respostas adaptativas do tipo Th1/Tc1, Th2/Tc2 e Th17/Tc17 mais exacerbadas, além de induzirem uma maior frequência de linfócitos T regulares, mostrando pela primeira vez a capacidade de EVs fúngicas em modular uma resposta adaptativa celular.
- ItemImunossupressão na paracoccidioidomicose murina: envolvimento das células supressoras mieloides (MDSCs) na imunidade dos hospedeiros.(Universidade Federal de São Paulo, 2023-06-28) Preite, Nycolas Willian [UNIFESP]; Loures, Flávio Vieira [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1228226400148048; http://lattes.cnpq.br/3914043576091725Previous studies in paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America, revealed that the immunity of hosts is strongly regulated by several suppressive mechanisms mediated by tolerogenic plasmacytoid dendritic cells, by the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO-1) and by regulatory T cells (Treg). IDO-1 has also been seen to orchestrate local and systemic immunosuppressive effects through the recruitment and activation of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), a heterogeneous population of myeloid cells with a potent ability to suppress T cell responses. These cells regulate immune responses and tissue repair in healthy individuals and rapidly expand during infection. However, the involvement of MDSC during PCM was never investigated. The presence, phenotype, and immunosuppressive mechanisms of MDSCs were evaluated at 96 hours, 2 and 8 weeks of infection in C57BL/6 mice. In addition, disease severity and various characteristics of the immune response were evaluated in MDSC-depleted or non-MDSC-depleted mice using three different in vivo treatment strategies: antibody against Gr1+ cells, LXR receptor agonists, and the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU). We observed that both monocytic MDSCs (M-MDSCs) and polymorphonuclear MDSCs (PMN-MDSCs) massively infiltrate the lungs during P. brasiliensis infection. We were also able to demonstrate that the partial reduction of MDSC promoted treatments with 5-FU or anti-Gr1 resulted in more prominent Th1/Th17 lymphocyte responses. This more robust immune response resulted in a regressive disease with reduced fungal burden on target organs and decreased lung pathology when compared to a control group. On the other hand, treatment by LXR receptor agonists wasn't able to deplete MDSCs during PCM. MDSC suppressive activity on CD4 and CD8 lymphocytes, as well as on Th1/Th17 cells, has also been demonstrated in vitro in co-culture experiments. In contrast, adoptive transfer of MDSCs to mice infected with P. brasiliensis resulted in more severe disease. Together, our data show that MDSC abundance in the PCM was linked to more severe disease and was associated with weakened Th1 and Th17 protective immune responses. However, the protective cellular immune response could be rescued by treatments mediated by partial or total depletion of MDSCs, which resulted in less severe disease and controlled tissue pathology. Thus, MDSCs emerge as a potential target cell for adjuvant therapy of PCM.
- ItemAnálise proteômica da sinalização heterotípica em cultura celular de melanoma(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2021) Goncalves, Dayelle Samila Pessotti De Oliveira [UNIFESP]; Pereira, Andre Zelanis Palitot [UNIFESP]; Universidade Federal de São PauloThe signaling events triggered by soluble mediators released from both transformed and stromal cells shape the phenotype of tumoral cells and have significant implications in cancer development and progression. In this study we performed an in vitro heterotypic signaling assay by evaluating the proteome diversity of human dermal fibroblasts after their stimulation with the conditioned media obtained from malignant melanoma cells. In addition, we also evaluated the changes in the proteome of melanoma cells after their stimulation with their own conditioned media as well as with the conditioned medium from melanoma-stimulated fibroblasts. Our results pointed out to a significant rearrangement in the proteome of stromal (Hs68) and malignant (A375) cells upon crosstalk of soluble mediators. The main proteome signature of stimulated cells was related to protein synthesis, which may indicate that this process might be an early response of stimulated stromal cells. In addition, the conditioned medium derived from ‘primed’ stromal cells (melanoma-stimulated fibroblasts) was more effective in altering the functional phenotype (cell migration) of malignant cells than the fibroblast conditioned medium alone. Collectively, self- and cross-stimulation may play a key role in shaping the tumor microenvironment and, more importantly, enable tumoral cells to succeed in the process of melanoma progression and metastasis. Although the proteome landscape of cells participating in such a heterotypic signaling represents a snapshot of a highly dynamic state, understanding the diversity of proteins and enriched biological pathways resulting from stimulated cell states may allow for targeting specific cell regulatory motifs involved in melanoma progression and metastasis.