Glipicam-1 no glioblastoma humano: implicações na tumorigênese e na quimioterapia
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Data
2019-10-31
Autores
Listik, Eduardo [UNIFESP]
Orientadores
Toma, Leny [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Introduction: Glioblastoma is one of the most common malignant brain tumors, in which patients have a mean survival of 24 months. The scientific literature has revealed evidence that glypican-1 is overexpressed in human glioblastoma and is negatively correlated with patient’s survival. Glypican-1 is a membrane-bound heparan sulfate proteoglycan, and the heparan sulfate GAG chains are classically known to interact with morphogens frequently associated with cancer. Objective: This study aims to investigate how glypican-1 influences the tumoral profile of human glioblastoma using in vitro cell line models. Methods: Glypican-1 was knocked-down from U-251 MG cells using shRNA followed by clonal selection. The glypican-1 silencing effects were assessed by profiling transcriptional discrepancies using RT-qPCR as well as other techniques such as flow cytometry, cell viability, migration, proliferation, adhesion, clonogenicity, and susceptibility to temozolomide. Confocal microscopy was used to investigate glypican1 localization in lipid rafts or its association with syndecan-4 and glypican-3. Results: Glypican-1 was associated with the expression of other heparan sulfate proteoglycans and metalloproteases. By downregulating glypican-1, the cellular growth rate was reduced by up to 71% and proliferation up to 54%, in which cells were significantly shifted towards G0 as opposed to G1 phases. Cellular migration was severely affected and may be almost abolished by negatively modulating glypican-1. Glioblastoma U-251 MG cells poorly adhered to laminin but showed high affinity to type IV collagen and vitronectin. However, glypican-1 solely affected the affinity towards laminin binding of glioblastoma U-251 MG cells, although slower kinetic adhesion profiles were observed when the proteoglycan was knocked down. This proteoglycan was highly prevalent in glioblastoma cells, being primarily localized in the cellular membrane and extracellular vesicles, occasionally with glypican-3. Glypican-1 could also be found in cell-cell junctions with syndecan-4 but was not identified in lipid rafts in this study. Glypican-1 was also revealed to be a probable mediator of temozolomide resistance mechanisms in glioblastoma, as glypican-1-silenced cells were much more susceptible to this alkylating agent than in U-251 MG itself. Conclusion: We present evidence not only to support facts that glypican-1 is an elementary macromolecule in glioblastoma tumoral microenvironment, but also to introduce this proteoglycan as a promising therapeutic target for this highly malignant tumor.
Introdução: O glioblastoma é um dos tumores cerebrais malignos mais comuns, em que os pacientes possuem uma sobrevida média de 24 meses. A literatura científica revelou evidências de que o glipicam-1 é superexpresso no glioblastoma humano e está negativamente correlacionado com a sobrevivência desses pacientes. O glipicam-1 é um proteoglicano de heparam sulfato de membrana, cujas cadeias de heparam sulfato são classicamente conhecidas por se associar a morfógenos, frequentemente associados ao câncer. Objetivo: Este estudo tem como objetivo investigar como o glipicam-1 influencia o perfil tumoral no glioblastoma humano por meio de modelos com linhagens celulares in vitro. Métodos: O glipicam-1 foi silenciado das células U-251 MG utilizando um shRNA específico, seguido de uma seleção clonal. Os efeitos do silenciamento foram avaliados pela análise de discrepâncias transcricionais avaliadas por meio de RTqPCR, bem como por outras técnicas, como citometria de fluxo, atividade metabólica, migração, proliferação, adesão, e clonogenicidade celulares; e ensaio de susceptibilidade à temozolomida. A microscopia confocal foi empregada para investigar a localização de glipicam-1 em balsas lipídicas ou sua associação com sindecam-4 e glipicam-3. Resultados: O glipicam-1 mostrou estar associado à expressão de outros proteoglicanos de heparam sulfato e determinadas metaloproteases. Pelo silenciamento de glipicam-1, a taxa de crescimento celular foi reduzida em até 71% e a proliferação em 54%, sendo que os clones celulares indicaram estar preferencialmente na fase G0 do ciclo celular em vez de G1. A migração celular foi severamente afetada pela depleção do proteoglicano. Células U-251 MG aderiram mal à laminina, mas tiveram alta afinidade ao colágeno do tipo IV e à vitronectina. No entanto, o glipican-1 apenas influenciou diretamente a afinidade de ligação das células U-251 MG à laminina, embora uma cinética de adesão mais lenta foi observada mediante o knock-down. Glipicam-1 revelou ser altamente prevalente nas células de glioblastoma, primariamente residindo na membrana celular e em vesículas extracelulares, ocasionalmente associado ao glipicam-3. O glipicam-1 também pôde ser identificado em junções célula-célula juntamente com sindecam-4, mas não foi identificado em balsas lipídicas neste estudo. Este proteoglicano também revelou indícios de ser um potencial mediador dos mecanismos de resistência à temozolomida no glioblastoma, uma vez que células silenciadas para glipicam-1 foram mais susceptíveis a este agente alquilante em relação à linhagem controle U-251 MG. Conclusão: Neste trabalho, apresentamos dados que evidenciam a importância do glipicam-1 como uma macromolécula fundamental no microambiente tumoral do glioblastoma humano, e que também representa um alvo terapêutico promissor para este tumor altamente maligno.
Introdução: O glioblastoma é um dos tumores cerebrais malignos mais comuns, em que os pacientes possuem uma sobrevida média de 24 meses. A literatura científica revelou evidências de que o glipicam-1 é superexpresso no glioblastoma humano e está negativamente correlacionado com a sobrevivência desses pacientes. O glipicam-1 é um proteoglicano de heparam sulfato de membrana, cujas cadeias de heparam sulfato são classicamente conhecidas por se associar a morfógenos, frequentemente associados ao câncer. Objetivo: Este estudo tem como objetivo investigar como o glipicam-1 influencia o perfil tumoral no glioblastoma humano por meio de modelos com linhagens celulares in vitro. Métodos: O glipicam-1 foi silenciado das células U-251 MG utilizando um shRNA específico, seguido de uma seleção clonal. Os efeitos do silenciamento foram avaliados pela análise de discrepâncias transcricionais avaliadas por meio de RTqPCR, bem como por outras técnicas, como citometria de fluxo, atividade metabólica, migração, proliferação, adesão, e clonogenicidade celulares; e ensaio de susceptibilidade à temozolomida. A microscopia confocal foi empregada para investigar a localização de glipicam-1 em balsas lipídicas ou sua associação com sindecam-4 e glipicam-3. Resultados: O glipicam-1 mostrou estar associado à expressão de outros proteoglicanos de heparam sulfato e determinadas metaloproteases. Pelo silenciamento de glipicam-1, a taxa de crescimento celular foi reduzida em até 71% e a proliferação em 54%, sendo que os clones celulares indicaram estar preferencialmente na fase G0 do ciclo celular em vez de G1. A migração celular foi severamente afetada pela depleção do proteoglicano. Células U-251 MG aderiram mal à laminina, mas tiveram alta afinidade ao colágeno do tipo IV e à vitronectina. No entanto, o glipican-1 apenas influenciou diretamente a afinidade de ligação das células U-251 MG à laminina, embora uma cinética de adesão mais lenta foi observada mediante o knock-down. Glipicam-1 revelou ser altamente prevalente nas células de glioblastoma, primariamente residindo na membrana celular e em vesículas extracelulares, ocasionalmente associado ao glipicam-3. O glipicam-1 também pôde ser identificado em junções célula-célula juntamente com sindecam-4, mas não foi identificado em balsas lipídicas neste estudo. Este proteoglicano também revelou indícios de ser um potencial mediador dos mecanismos de resistência à temozolomida no glioblastoma, uma vez que células silenciadas para glipicam-1 foram mais susceptíveis a este agente alquilante em relação à linhagem controle U-251 MG. Conclusão: Neste trabalho, apresentamos dados que evidenciam a importância do glipicam-1 como uma macromolécula fundamental no microambiente tumoral do glioblastoma humano, e que também representa um alvo terapêutico promissor para este tumor altamente maligno.