Uso do modo de operação em contínuo para avaliar aspectos fisiológicos de linhagem recombinante de drosophila melanogaster

Uso do modo de operação em contínuo para avaliar aspectos fisiológicos de linhagem recombinante de drosophila melanogaster

Author Oliveira, Carla Reis Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Augusto, Elisabeth De Fatima Pires Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biotecnologia
Abstract Glycoproteins are complex molecules produced preferentially by animal cells, but their quality pattern rely on the knowledge of cell metabolism and requires engineering tools to ensure greater uniformity and productivity. As long as reports on the metabolism of insect cells are scarce, researches on the physiological aspects of Drosophila*melanogaster are of utmost importance to promote their usage. In order to contribute on the knowledge of this metabolism, the present work aimed to identify growth limiting and inhibitory factors of S2AcRVGP2, a D.*melanogaster S2 cell line stably transfected for the synthesis of Rabies virus glycoprotein (GPV). This study was conducted using TC100 based medium in spinner flasks and in benchtop bioreactor stirred at 100 rpm and with bubbleLfree aeration system. Exploratory cultures on batch mode were carried out with different concentrations of LLcystine (CYS2) and magnesium (Mg2+). The influence on the metabolism of different glucose concentrations (GLC) in the feed medium was studied in a continuous mode. It has been shown that lactate and ammonium did not seem to be growth inhibiting. The supplementation with CYS2 11 mg/L enhanced GPV expression by 75% in batch with initial supplementation and 21% in batch with pulse addition at the end of exponential phase. The evaluation of Mg2+ influence on cell growth kinetic parameters showed that when cultivated with half of its basal concentration, cell production increased 37%, but when cultured on [Mg2+] inferior to 121 mg/L, it limited the growth rate and altered cell membrane morphology. Continuous culture with glucose concentration above 3.75 g/L in the feed medium indicated overflow on glycolysis with consequently limitation of cell growth. The metabolism shifted to a more balanced state when fed with glucose concentration under 2.5 g/L. Cell production increased by 40% and GPV expression doubled in the lowest glucose concentration evaluated (1.25 g/L).

Glicoproteínas terapêuticas são moléculas complexas obtidas por bioprocessos empregando preferencialmente células animais. Assegurar o padrão de qualidade desses produtos depende do conhecimento do metabolismo celular e exige o aperfeiçoamento de técnicas de engenharia que garantam maior uniformidade e rentabilidade. Como as informações acerca do metabolismo de células de inseto ainda são escassas, investigar os aspectos metabólicos da linhagem S2 de Drosophila* melanogaster é de fundamental importância para fomentar sua utilização na manufatura de biofármacos. No intuito de contribuir com os conhecimentos desse metabolismo, o presente trabalho visou identificar os fatores limitantes e inibitórios do crescimento da linhagem S2AcRVGP2, estavelmente transformada para síntese da glicoproteína do vírus rábico (GPV). O estudo foi conduzido utilizando meio de cultura TC100 modificado em frascos do tipo spinner e em biorreator de bancada com sistema de aeração sem bolhas. Foram realizados cultivos exploratórios em batelada com diferentes concentrações de LLcistina (CYS2) e magnésio (Mg2+) e, posteriormente, se estudou em biorreator operado em modo contínuo a influência no metabolismo de diferentes concentrações de glicose (GLC) no meio de alimentação. Nas condições avaliadas, metabólitos como lactato e amônio não aparentam ser inibidores ao crescimento. O incremento de 11 mg/L de CYS2 favoreceu a expressão de GPV, aumentando seu teor em 75% em batelada com suplementação inicial e em 21% em batelada com adição em pulso no fim da fase exponencial. O cultivo com metade da concentração basal de Mg2+ aumentou em 37% a produção de células, mas cultivos com [Mg2+] inferior a 121 mg/L apresentaram limitação do crescimento e alteração morfológica da membrana celular. Por fim, os ensaios em modo de operação contínuo indicaram que em condições de excesso de GLC (acima de 3,75 g/L) o fluxo metabólico na via glicolítica é intenso, levando à limitação do crescimento celular. A menor concentração de GLC avaliada (1,25 g/L) tornou o metabolismo mais balanceado, aumentando a produção de células em 40% e dobrando a expressão de GPV.
Keywords Drosophila
Melanogaster
Continuous Bioprocess
Metabolism
Animal Cells
Bioreactor
Recombinant Protein
Rabies Virus Glycoprotein
Drosophila
Melanogaster
Processo contínuo
Metabolismo
Células Animais
Biorreator
Proteína Recombinante
Glicoproteína Do Vírus Da Raiva
Language Portuguese
Date 2019-02-19
Research area Fisiologia Molecular E Modelos Animais
Knowledge area Biotecnologia Em Sistemas Fisiologicos
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 123 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=7693838
Access rights Closed access
Type Thesis
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59336

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