Investigação das moléculas envolvidas na permeabilização das membranas e na regulação do processo de egresso de plasmodium falciparum na hemácia infectada
Data
2019-07-31
Autores
Melo, Hamille Rocha 
Orientadores
Azevedo, Mauro Ferreira de
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction: In spite of the recent advances towards its control, malaria is still a burden to society, killing mainly children under five years of age. While successful treatment with total cure is available, drug resistance threatens patients care in the future and therefore, new antimalarial medicines are required. A potential target for chemotherapeutic intervention is host cell egress, a tightly regulated process that happens after parasites grow and multiply inside the human erythrocytes. Parasite enzymes are known to act in concert dismantling parasitophorous vacuole (PV) and red blood cell (RBC) membranes, but the hierarchy of their action is not completely understood. Objectives: The aims of this study were to establish a method that can be applied to identify compounds that affect egress and to investigate the sequence of the biochemical events involved. Methods: In order to synchronize parasites in two key moments that precede egress, P. falciparum 3D7 parasites were engineered to express endogenous calcium dependent protein kinase 5 (CDPK5) or protein kinase G (PKG) in fusion with a destabilization domain (DD). Expression of each DD tagged kinase is dependent on the ligand Shld-1 and its removal reversibly block egress. Expression of the sensitive reporter nanoluc (NLuc) either secreted do the PV or exported to the RBC was applied to quantify egress. Results: As expected, removal of Shld-1 nearly completely blocked egress in both transgenic lines and when Shld-1 was reintroduced to cultures previously synchronized with sorbitol and heparin at 4548 hours post invasion, Nluc activity in the supernatant increased in CDPK5-DD and PKG-DD cultures after 1 and 2 hours respectively. Microscopic and FACS analysis confirmed the increase in reporter activity correlated to egress. About a couple dozen compounds were evaluated. Egress of CDPK5-DD and PKG-DD were affected differently by a few compounds, demonstrating the method can be applied identify parasite enzymes and/or signalling pathways that act after PKG and before CDPK5. Conclusion: Remarkably, data provided by this study suggest a calpain and a few kinases such as PKA act temporally between PKG and CDPK5. Application of this protocol might allow the identification of many more compounds that affect egress and elucidating when their targets are required respectively to PKG and CDPK5 activation.
Introdução: Apesar dos recentes avanços em direção ao seu controle, a malária é uma ameaça para a sociedade, matando principalmente crianças menores de cinco anos de idade. Embora o tratamento bem-sucedido para a cura total esteja disponível, a resistência a medicamentos ameaça os pacientes no futuro e, portanto, novos antimaláricos são necessários. Um alvo potencial para a intervenção quimioterápica é a saída do parasita da célula hospedeira, um processo rigidamente regulado que ocorre após os parasitas crescerem e se multiplicarem dentro do eritrócito humano. Sabe-se que as enzimas dos parasitas atuam em conjunto desmantelando as membranas do vacúolo parasitóforo (PV) e das células vermelhas do sangue (RBC), mas a hierarquia da sua ação não é completamente compreendida. Objetivos: Os objetivos desse estudo foram estabelecer um método que possa ser aplicado para identificar compostos que afetam a saída e investigar a sequência dos eventos bioquímicos envolvidos. Métodos: Para sincronizar os parasitas em dois momentos chaves que precedem a saída, os parasitas P. falciparum 3D7 foram projetados para expressar a proteína quinase dependente de cálcio 5 (CDPK5) ou a proteína quinase G (PKG) em fusão com o domínio de desestabilização (DD). A expressão de cada quinase marcada com o DD é dependente do ligante SHLD-1 e a sua remoção bloqueia reversivelmente a saída. Os parasitas que expressam o repórter nanoluc (Nluc) secretado no PV ou exportado para o RBC foi aplicado para quantificar a saída. Resultados: Como esperado, a remoção do Shld-1 bloqueou quase completamente a saída em ambas as linhagens transgênicas, e quando o Shld-1 foi reintroduzido em culturas previamente sincronizadas com sorbitol e heparina em 45-48 horas após a invasão, a atividade de Nluc no sobrenadante aumentou em CDPK5-DD e PKG-DD nas culturas após 1 e 2 horas, respectivamente. A análise microscópica e a citometria de fluxo confirmou o aumento da atividade do repórter correlacionada ao egresso. Mais de 20 compostos foram avaliados. A saída de CDPK5-DD e PKG-DD foi afetada diferentemente por alguns compostos, demonstrando que o método pode ser aplicado para identificar enzimas e/ou vias de sinalização do parasita que atuam após a PKG e antes da CDPK5. Conclusão: Notavelmente, os dados fornecidos por este estudo sugerem uma calpaína e algumas quinases como a PKA atuam temporariamente entre PKG e CDPK5. A aplicação deste protocolo pode permitir a identificação de mais compostos que afetam a saída e elucidar quando seus alvos são necessários, respectivamente, para a ativação de PKG e CDPK5.
Introdução: Apesar dos recentes avanços em direção ao seu controle, a malária é uma ameaça para a sociedade, matando principalmente crianças menores de cinco anos de idade. Embora o tratamento bem-sucedido para a cura total esteja disponível, a resistência a medicamentos ameaça os pacientes no futuro e, portanto, novos antimaláricos são necessários. Um alvo potencial para a intervenção quimioterápica é a saída do parasita da célula hospedeira, um processo rigidamente regulado que ocorre após os parasitas crescerem e se multiplicarem dentro do eritrócito humano. Sabe-se que as enzimas dos parasitas atuam em conjunto desmantelando as membranas do vacúolo parasitóforo (PV) e das células vermelhas do sangue (RBC), mas a hierarquia da sua ação não é completamente compreendida. Objetivos: Os objetivos desse estudo foram estabelecer um método que possa ser aplicado para identificar compostos que afetam a saída e investigar a sequência dos eventos bioquímicos envolvidos. Métodos: Para sincronizar os parasitas em dois momentos chaves que precedem a saída, os parasitas P. falciparum 3D7 foram projetados para expressar a proteína quinase dependente de cálcio 5 (CDPK5) ou a proteína quinase G (PKG) em fusão com o domínio de desestabilização (DD). A expressão de cada quinase marcada com o DD é dependente do ligante SHLD-1 e a sua remoção bloqueia reversivelmente a saída. Os parasitas que expressam o repórter nanoluc (Nluc) secretado no PV ou exportado para o RBC foi aplicado para quantificar a saída. Resultados: Como esperado, a remoção do Shld-1 bloqueou quase completamente a saída em ambas as linhagens transgênicas, e quando o Shld-1 foi reintroduzido em culturas previamente sincronizadas com sorbitol e heparina em 45-48 horas após a invasão, a atividade de Nluc no sobrenadante aumentou em CDPK5-DD e PKG-DD nas culturas após 1 e 2 horas, respectivamente. A análise microscópica e a citometria de fluxo confirmou o aumento da atividade do repórter correlacionada ao egresso. Mais de 20 compostos foram avaliados. A saída de CDPK5-DD e PKG-DD foi afetada diferentemente por alguns compostos, demonstrando que o método pode ser aplicado para identificar enzimas e/ou vias de sinalização do parasita que atuam após a PKG e antes da CDPK5. Conclusão: Notavelmente, os dados fornecidos por este estudo sugerem uma calpaína e algumas quinases como a PKA atuam temporariamente entre PKG e CDPK5. A aplicação deste protocolo pode permitir a identificação de mais compostos que afetam a saída e elucidar quando seus alvos são necessários, respectivamente, para a ativação de PKG e CDPK5.
Descrição
Citação
MELO, Hamille Rocha. Investigação das moléculas envolvidas na permeabilização das membranas e na regulação do processo de egresso de plasmodium falciparum na hemácia infectada. 2019. 73 f. Dissertação (Mestrado em Bioprodutos e Bioprocessos) - Universidade Federal de São Paulo, Instituto de Saúde e Sociedade, Santos, 2019.